Physico-chemical na katangian ng mga protina. Mga Paraan ng Pagdalisay ng Protina at Pagkilala
header
2
2
Ang paghihiwalay at paglilinis ng mga protina ay isinasagawa sa mga yugto.
1. homogenisasyon- ito ay isang masusing paggiling ng mga bagay ng biochemical na pananaliksik sa isang homogenous, iyon ay, isang homogenous na estado, iyon ay, ang mga protina ay sumasailalim sa masusing disintegration hanggang sa pagkawasak ng cell wall.
Sa paggawa nito, ginagamit nila ang:
a) Warring-type na mga homogenizer ng kutsilyo;
b) pestle homogenizers Potter - Elveheim;
sa) ball at roller mill - para sa mas siksik na mga bagay;
G) ang paraan ng kahaliling pagyeyelo at lasaw, habang ang pagkalagot ng cell wall ay nangyayari sa ilalim ng pagkilos ng mga kristal na yelo;
e) ang paraan ng "bomba ng nitrogen" - sa ilalim ng mataas na presyon, ang mga cell ay puspos ng nitrogen, pagkatapos ay ang presyon ay biglang inilabas, ang gas na nitrogen ay inilabas, na kung saan, parang sumabog ang cell mula sa loob;
e) Ultrasound, iba't ibang mga paraan ng pagpindot, panunaw ng mga pader ng cell na may mga enzyme. Sa karamihan ng mga kaso, ang init ay inilabas sa panahon ng homogenization, habang maraming mga protina ang maaaring hindi aktibo, kaya ang lahat ng mga pamamaraan ay isinasagawa sa malamig na mga silid sa t 0 o ang mga hilaw na materyales ay pinalamig ng yelo. Kasabay nito, ang dami at oras ng pagkasira ng cell, pati na rin ang operating pressure, ay maingat na kinokontrol. Ang isang perpektong homogenizate ay isa na maaaring higit pang makuha.
2. Pagkuha ng protina, iyon ay, ang kanilang paglipat sa isang dissolved state; kadalasan, ang pagkuha ay isinasagawa kasama ng paggiling sa parehong oras.
Ang pagkuha ay isinasagawa:
a) paglusaw sa 8-10% na solusyon sa asin;
b) gamit ang mga solusyon sa buffer na may pH mula acidic hanggang bahagyang alkalina (borate, phosphate, citrate, tris - buffer: isang halo ng trisaminometane na may NH2 - CH3 + HCl;
sa) pag-ulan ng mga protina na may mga organikong solvent (ethanol, methanol, butanol, acetone at ang kanilang mga kumbinasyon), habang hinahati ang mga bahagi ng protina-lipid at protina-protina, iyon ay, ang pagkasira ng HSB.
3. Purification at fractionation ng mga protina. Pagkatapos ng pagkuha, ang halo ay pinaghihiwalay o hinahati sa mga indibidwal na protina at higit pang dinadalisay:
a) pag-aasin ay ang proseso ng pag-ulan ng mga protina sa pamamagitan ng mga neutral na solusyon sa asin ng alkali at alkaline earth na mga metal.
mekanismo ng pag-aasin– ang mga idinagdag na anion at cation ay sumisira sa hydrated protein shell ng mga protina, na isa sa mga kadahilanan ng katatagan ng mga solusyon sa protina. Kadalasan, ginagamit ang mga solusyon ng Na at ammonium sulfate. Maraming mga protina ang nagkakaiba sa laki ng hydration shell at sa magnitude ng singil. Ang bawat protina ay may sariling salting out zone. Matapos tanggalin ang salting out agent, pinapanatili ng protina ang biological activity at physicochemical properties nito. Sa klinikal na kasanayan, ang paraan ng salting out ay ginagamit upang paghiwalayin ang mga globulin (kasama ang pagdaragdag ng 50% ammonium sulfate solution (NH 4) 2SO 4 isang namuong form) at albumin (na may pagdaragdag ng 100% ammonium sulfate solution (NH 4) 2SO 4 a precipitate forms).
Ang pag-asin ay naiimpluwensyahan ng:
1) kalikasan at konsentrasyon ng asin;
2) pH na kapaligiran;
3) temperatura.
Ang pangunahing papel ay nilalaro ng mga valencies ng mga ions. Samakatuwid, ang epekto ng asin ay sinusuri ng lakas ng ionic ng solusyon μ:
, iyon ay, ang lakas ng ionic ng solusyon (μ) ay katumbas ng produkto ng ½ ng konsentrasyon ng bawat ion (C) at ang parisukat ng valence nito (V).
Ang paraan ng Kohn ay isang uri ng pag-aasin. Kasabay nito, ang pagkuha at pag-ulan ng mga sangkap ay nagaganap. Sa pamamagitan ng sunud-sunod na pagbabago ng temperatura (karaniwan ay mababa t o -0 + 8 o C), ang pH ng solusyon at puro ethanol, hanggang 18 na mga fraction ng protina ay sunud-sunod na nakahiwalay sa plasma ng dugo.
Paraan ng Kohn ginagamit sa produksyon ng pharmaceutical sa paggawa ng mga pamalit sa dugo;
b) mga pamamaraan ng chromatography. Ang siyentipikong Ruso na si Mikhail Tsvet (1903) ay itinuturing na tagapagtatag ng pagbuo ng mga pamamaraan ng pagsusuri ng chromatographic. Sa kasalukuyan, maraming uri nito. Ang pamamaraan ay batay sa kakayahan ng mga sangkap na partikular na i-adsorbed sa isang adsorbent na nakapaloob sa isang haligi o ilagay sa ilang carrier. Kapag nangyari ito, ang paghihiwalay ng mga nasuri na sangkap at ang kanilang konsentrasyon sa isang mahigpit na tinukoy na layer ng adsorbent. Pagkatapos, ang mga naaangkop na eluent (mga solvent) ay ipinapasa sa column, na nagpapahina sa mga puwersa ng adsorption at naghuhugas ng mga adsorbed substance mula sa column. Ang mga sangkap ay kinokolekta sa fraction collector.
Ang pangunahing sa chromatography ay ratio ng pamamahagi, na katumbas ng ratio ng konsentrasyon ng isang sangkap sa mobile phase sa konsentrasyon ng sangkap sa nakatigil na yugto(o nakatigil na yugto).
Nakatigil na nakatigil na yugto– maaaring solid o likido o pinaghalong solid at likido.
mobile phase- likido o gas, ito ay dumadaloy sa nakatigil, o dinadaanan nito.
Depende sa uri ng nakatigil at mobile na bahagi, mayroong iba't ibang mga pagbabago ng pagsusuri ng chromatographic.
Adsorption- ay batay sa iba't ibang antas ng adsorption ng mga protina ng adsorbent at ang kanilang solubility sa kaukulang solvent.
Ang mga adsorbents na ginamit ay silicic acid, Al 2 O 3 , CaCO 3 , MgO, uling. Ang adsorbent sa anyo ng isang suspensyon na may solvent (karaniwan ay may buffer solution) ay nakaimpake sa isang haligi (glass vertical tube). Ang sample ay inilapat sa haligi, pagkatapos ay isang solvent o pinaghalong solvents ang dumaan dito.
Ang paghihiwalay ay batay sa katotohanan na ang mga sangkap na may mas mataas na pamamahagi ng K. (B) gumagalaw sa kahabaan ng column sa mas mabilis na bilis. Ang mga fraction ay kinokolekta gamit ang isang fraction collector.
Partition chromatography- batay sa pamamahagi ng pinaghalong protina sa pagitan ng dalawang likidong phase. Ang paghihiwalay ay maaaring maganap sa espesyal na chromatographic na papel, pati na rin sa mga haligi, tulad ng sa adsorption. Ang solid phase sa kasong ito ay nagsisilbi lamang bilang isang suporta para sa likidong nakatigil na yugto. Ang Chromatographic na papel ay may pag-aari ng pagpapanatili ng tubig sa pagitan ng mga hibla ng selulusa nito. Ang tubig na ito ay isang nakatigil na yugto. Kapag ang isang non-aqueous solvent (mobile phase) ay gumagalaw sa papel sa ilalim ng pagkilos ng mga capillary forces, ang mga molecule ng substance na idineposito sa papel ay ipinamamahagi sa pagitan ng dalawang phase alinsunod sa kanilang distribution coefficient. Kung mas mataas ang solubility ng isang substance sa mobile phase, mas lalo itong lilipat kasama ang papel kasama ng solvent.
Sa kaso ng pamamahagi ng chromatography sa isang haligi, ang mga carrier ay selulusa, almirol, silica gel, atbp., ang nakatigil na yugto ay tubig. Kapag inilapat sa haligi, ang mga sangkap ng pinaghalong gumagalaw kasama ang haligi sa iba't ibang bilis, na isinasaalang-alang ang Krasp.
Ang Rf para sa bawat tambalan sa ilalim ng karaniwang mga kondisyon ay isang pare-parehong halaga.
Ion exchange chromatography - batay sa pagkahumaling ng magkasalungat na sisingilin na mga particle. Para dito, ginagamit ang iba't ibang mga resin ng pagpapalit ng ion: ang mga resin ng cation-exchange ay naglalaman ng mga negatibong sisingilin na grupo - mga sulfonated styrene at CMC, na nakakaakit ng mga positibong sisingilin na mga ion ng mga sangkap na pinag-aaralan. Tinatawag din silang acid ion exchangers.
Ang mga anion exchange resin, o mga pangunahing ion exchanger, ay naglalaman ng mga grupong may positibong charge na umaakit sa mga molekula ng protina na may negatibong charge.
Ang trimethylaminostyrene ay isang derivative ng styrenes at cellulose.
Depende sa q ng mga protina na ihihiwalay, ang mga naaangkop na ion exchanger ay ginagamit, kung saan ang ilang mga protina ay nakikipag-ugnayan, habang ang iba ay malayang umalis sa column. Ang mga protina na "na-precipitate" sa column ay inaalis gamit ang mas concentrated na saline solution o sa pamamagitan ng pagbabago ng pH ng eluent.
Ang affinity chromatography (o affinity chromatography) ay batay sa prinsipyo ng selektibong interaksyon ng mga protina o iba pang macromolecule na may mga partikular na sangkap na hindi kumikilos sa mga carrier - ligand (maaari itong maging isang coenzyme kung ang isang enzyme, antibody, antigen, atbp. ay nakahiwalay. Dahil sa mataas na pagtitiyak ng mga protina, ang mga immobilized ligand ay nakakabit dito ng isang protina lamang sa bawat pinaghalong Hinugasan gamit ang mga buffer mixture na may binagong pH o binagong lakas ng ionic.
Ang kalamangan ay ang kakayahang ihiwalay ang isang naibigay na sangkap ng isang mataas na antas ng kadalisayan sa isang hakbang.
Ang paraan ng pagsasala ng gel o ang molecular sieve method ay isang uri ng permeation chromatography.
Ang paghihiwalay ng mga molekula ayon sa laki at hugis ay batay sa mga katangian ng molecular sieve na mayroon ang maraming porous na materyales, tulad ng mga organic polymer na may tatlong-dimensional na istraktura ng network na nagbibigay sa kanila ng mga katangian ng mga gel. Ang pagsasala ng gel ay ang paghihiwalay ng mga sangkap gamit ang mga gel batay sa mga pagkakaiba sa laki ng mga molekula (sepharose, sephadex, sephacryl, biogels, atbp.). Sa ilalim ng pagkilos ng epichlorohydrin, ang mga polysaccharide chain ng dextran (synthesize ng mga microorganism) ay na-crosslink sa isang istraktura ng network, nagiging hindi matutunaw sa tubig, ngunit nagpapanatili ng isang mataas na pagkakaugnay para dito. Dahil sa hydrophilicity na ito, ang mga nagresultang butil (tinatawag na Sephadex) ay bumukol nang malakas upang bumuo ng isang gel, na napuno sa column. Ang pamamaraan ay batay sa katotohanan na ang mga malalaking molekula ay hindi tumagos sa panloob na bahagi ng tubig, at ang mas maliliit na molekula ay unang tumagos sa mga pores ng "sala", na parang natigil sa kanila, at samakatuwid ay lumipat sa isang mas mababang bilis. Alinsunod dito, ang mga protina na may mas mataas na Mr ang unang pumasok sa receiver. Kamakailan lamang, ang mga buhaghag na butil ay lalong ginagamit bilang isang molecular sieve sa permeation chromatography.
Ang pamamaraan ng electrophoretic sa biochemistry ay batay sa pagkakaiba sa bilis ng paggalaw ng mga molekula sa isang electric field (amino acids, peptides, proteins, nucleic acids).
Ang pagkakaiba sa bilis ay nakasalalay sa:
1. sa q ng molekula: mas malaki ang kadaliang mapakilos ng mga molekula, mas malaki ang kabuuang q. Ang halaga ng q ay depende sa pH;
2. sa laki ng mga molekula: mas malaki ang mga molekula, mas mababa ang kanilang kadaliang kumilos. Ito ay dahil sa pagtaas ng mga puwersa ng friction at electrostatic na pakikipag-ugnayan ng malalaking molekula sa kapaligiran;
3. sa hugis ng mga molekula: ang mga molekula ng parehong laki, ngunit magkaibang mga hugis, halimbawa, ang mga fibril at protina globules ay may iba't ibang bilis. Ito ay dahil sa mga pagkakaiba sa mga puwersa ng friction at electrostatic interaction.
Mga uri ng electrophoresis
a) Isoelectric na pagtutok. Ang paghihiwalay ay nangyayari sa isang patayong column sa deg. parehong pH at boltahe. Sa tulong ng mga espesyal na carrier ng ampholytes, ang granizo ay itinatag sa haligi. pH mula 0 hanggang 14. Ang isang halo ng mga sangkap ay inilalagay sa haligi, at ang isang electric current ay konektado. Ang bawat isa sa mga bahagi ay gumagalaw sa bahaging iyon ng haligi kung saan ang halaga ng pH ay tumutugma sa isoelectric point nito at humihinto doon, iyon ay, ito ay nakatutok.
Kalamangan: pinaghihiwalay, dinadalisay at kinikilala ang mga protina sa isang hakbang. Ang pamamaraan ay may mataas na resolusyon (0.02 pI).
b) Ang Isotachophoresis ay electrophoresis sa pagsuporta sa media. Matapos i-on ang electric current, ang mga ions na may pinakamataas na mobility ay lumipat sa kaukulang elektrod muna, na may pinakamababa - ang huli, pagkakaroon ng intermediate mobility - ay matatagpuan sa gitna.
c) Disc electrophoresis - ang aparato ay binubuo ng dalawang sisidlan na may buffer - itaas at mas mababa, na konektado sa pamamagitan ng mga vertical na tubo na naglalaman ng isang gel ng iba't ibang mga pores. Habang ang mga ionized na particle ay gumagalaw sa ilalim ng pagkilos ng isang electric current. Ang mas mataas na porosity ay nasa tuktok ng gel.
d) Immunoelectrophoresis - isang paraan na pinagsasama ang electrophoresis sa immunodiffusion (para sa pagtuklas ng mga antigens sa mga kumplikadong physiological mixtures). Ang isang halo ng mga antigen at isang halo ng mga antibodies ay inilalagay patayo sa bawat isa sa isang espesyal na carrier. Kapag ang electric current ay naka-on, sila ay pinaghihiwalay sa mga indibidwal na sangkap at nagkakalat sa gel carrier. Sa tagpuan ng antigen na may kaukulang antibody, ang isang tiyak na reaksyon ng pag-ulan ay nangyayari sa anyo ng isang arko. Ang bilang ng mga nabuong arko ay tumutugma sa bilang ng mga antigen.
Mga pamamaraan para sa pagtukoy ng mga protina ng Mr
Sa isang malaking bilang ng mga protina, ang komposisyon ng kemikal at pagkakasunud-sunod ng amino acid ay hindi naitatag (1010–1012 protina), samakatuwid, si Mr. Iba't ibang paraan ang ginagamit para dito.
a) Paraan ng sedimentation - ang pagpapasiya ng Mr ay isinasagawa sa mga espesyal na centrifuges (ang unang centrifuge ay iminungkahi ng Swedish biochemist na si Svedberg), kung saan posible na lumikha ng isang centrifugal acceleration na 200 libo o higit pang beses na mas malaki kaysa sa acceleration ng gravity ng lupa. Ang Mr ay tinutukoy mula sa V sedimentation ng mga molekula. Habang lumilipat ang mga molekula mula sa gitna patungo sa periphery, nabuo ang isang matalim na interface ng protina-solvent. Ang sedimentation rate ay ipinahayag sa mga tuntunin ng sedimentation constant (S):
kung saan ang V ay ang bilis ng paggalaw ng interface ng protina-solvent (cm/s);
ay ang angular velocity ng rotor (rad/s);
Ang ay ang distansya mula sa gitna ng rotor hanggang sa gitna ng cell na may solusyon sa protina (cm).
Ang halaga ng sedimentation constant S, na katumbas ng 110–13 C, ay kinukundisyon bilang 1 at tinatawag na 1 Svedberg (S). Ang S para sa mga protina ay mula 1-50 S, minsan hanggang 100 S.
Ang Mr ng mga protina ay tinutukoy ng Svedberg equation:
kung saan ang R ay ang universal gas constant;
T ay ang ganap na temperatura sa Kelvin;
S ay ang sedimentation constant;
D ay ang diffusion coefficient;
ay ang density ng solvent;
Ang V ay ang bahagyang tiyak na dami ng gas.
Ang pamamaraang ito ay mahal dahil sa paggamit ng mga kagamitan.
Mas simple at mas mura:
b) Pagsala ng gel sa isang manipis na layer ng Sephadex.
Ang haba ng landas ng protina (sa mm) ay logarithmic kay Mr.
X - Mr ng gustong protina sa graph ng pagkakalibrate.
c) Disk electrophoresis sa isang polyacrylamide layer - mayroon ding kaugnayan sa pagitan ng logarithm Mr ng mga protina ng pagkakalibrate at ang haba ng kanilang landas.
Mga pamamaraan para sa pagtukoy ng homogeneity ng mga protina
Ang antas ng kadalisayan ng nakahiwalay na protina ay tinutukoy ng:
- ultracentrifugation;
- paraan ng disk-electrophoresis;
- iba't ibang paraan ng immunochemical;
- Ang pagpapasiya ng solubility ng protina (paraan ng Nortrop) ay batay sa panuntunan ng phase, ayon sa kung saan ang solubility ng isang purong sangkap sa ilalim ng ibinigay na mga eksperimentong kondisyon ay nakasalalay lamang sa temperatura, ngunit hindi nakasalalay sa konsentrasyon ng sangkap sa solid phase.
Kung ang protina ay homogenous, kung gayon ang isang inflection ay nakuha sa graph (a), kung mayroong mga impurities ng protina (b, c), pagkatapos ay makakakuha tayo ng ilang mga inflection ng saturation curve. Ang lahat ng mga protina ay may sariling mga indibidwal na solubility curves.
Ang libro ay ang unang aklat-aralin sa Russian sa mga pangunahing kaalaman ng protina at peptide mass spectrometry. Ang layunin ng publikasyong ito ay upang mainteresan ang mga kabataang mananaliksik sa isang nagbibigay-kaalaman, maganda at hinihingi na disiplina sa buong mundo, upang magbigay ng pagkakataon na mas epektibong ilapat ang mass spectrometry upang malutas ang mga pundamental at inilapat na mga problemang pang-agham. Ang libro ay nakasulat sa format ng mga lektura para sa mga nagsisimula, mahusay na isinalarawan at sinamahan ng isang kinatawan na listahan ng mga binanggit na panitikan.
Ang publikasyon ay inilaan para sa mga mag-aaral at nagtapos na mga mag-aaral ng kemikal, physicochemical, biological at medikal na espesyalidad; ay magiging kapaki-pakinabang sa mga mananaliksik na nagtatrabaho na sa larangan ng protina at peptide na pananaliksik o interesado sa siyentipikong lugar na ito.
| 7 | ||
| Ginamit na mga abbreviation | 9 | |
| Panimula | 11 | |
| Kabanata 1. Mga paraan ng ionization ng peptide at mga molekula ng protina | 14 | |
| 1.1. Mabilis na Atom Bombardment, FAB | 14 | |
| 1.2. Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI (Martix Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) 16 | ||
| 1.3. Electrospray Ionization, ESI | 19 | |
| Kabanata 2 Pagsukat sa Molecular Weight ng Peptides at Proteins | 25 | |
| Kabanata 3. Pagtatatag ng pangunahing istraktura ng peptides | 34 | |
| 3.1. Pagkasira ni Edman | 34 | |
| 3.2. Pagkilala sa mga peptides sa pamamagitan ng pagkakasunud-sunod ng cDNA | 36 | |
| 3.3. Pagsunod-sunod ng ledder | 37 | |
| Kabanata 4 Mass Spectrometric Sequencing | 39 | |
| 4.1. Nomenclature ng peptide fragment ions | 39 | |
| 4.2. Mass spectra ng mga negatibong ion | 45 | |
| 4.3. Mga pamamaraan para sa pagsisimula ng fragmentation ng mga molekular na ion 46 | ||
| 4.3.1. Collisionally Activated Dissociation (CAD) Collisionally Activated Dissociation (CAD) | 47 | |
| 4.3.2. Dissociation na dulot ng mga banggaan sa ibabaw, DIP (Surface Induced Dissociation (SID) | 56 | |
| 4.3.3. Electron Capture Dissociation, ECD | 59 | |
| 4.3.4. Electron Transfer Dissociation, ETD | 64 | |
| 4.3.5. Photoactivation dissociation | 65 | |
| 4.3.6. Ang dissociation ay isinaaktibo ng mga electron | 69 | |
| 4.3.7. Dissociation ng mga negatibong ion sa pag-detachment ng isang electron | 70 | |
| 4.4. Mga pamamaraan para sa pagkakasunud-sunod ng mga peptide sa mga device na may matrix-assisted laser desorption/ionization | 71 | |
| 4.4.1. naantala na paraan ng pagkuha. Pagkabulok sa pinagmulan, RVI (In Source Decay, ISD) | 71 | |
| 4.4.2. Pagkabulok na lampas sa pinagmulan, FIR (Post Source Decay, PSD) | 72 | |
| Kabanata 5. Pagkilala sa Protina at Peptide | 7 6 | |
| 5.1. Pagkilala sa Database | 76 | |
| 5.1.1. Paraan ng pagkilala sa protina "bottom-up" ("Bottom-up") | 76 | |
| 5.1.2. Paraan ng pagkilala sa protina "top-down" ("Top-down") | 91 | |
| 5.2. Manu-manong pagkilala sa mga peptide | 94 | |
| Kabanata 6 | 97 | |
| 6.1. Saklaw ng pagkakasunud-sunod | 98 | |
| 6.2. Mga amino acid na may parehong integer mass | 102 | |
| 6.2.1. lysine at glutamine | 102 | |
| 6.2.2. Phenylalanine at oxidized methionine | 104 | |
| 6.3. Isomeric amino acids: leucine at isoleucine | 106 | |
| 6.4. Cyclization ng maikling peptides | 108 | |
| 6.5. Mga peptide na naglalaman ng disulfide bond | 116 | |
| Kabanata 7. Paggamit ng Negative Ion Mass Spectra para sa Sequencing | 121 | |
| Kabanata 8 Dami ng proteomics | 126 | |
| 8.1. Comparative (quantitative) proteomics | 129 | |
| 8.1.1. Isotope-free na pamamaraan | 129 | |
| 8.1.2. Isotopic na pamamaraan | 132 | |
| 8.2. Pagtatatag ng ganap na dami | 145 | |
| Bibliograpiya | 149 | |
| Apendise. Bruker: Isang Multidimensional na Landas sa Unraveling the Proteome | 163 | |
Paunang salita
Dedicated
mga propesor ng Faculty of Chemistry
Moscow State University M.V. Lomonosov
Alexander Leonidovich Kurts
Kim Petrovich Butin
Ang pinakamahalagang tagumpay ng mass spectrometry sa nakalipas na 20 taon ay nauugnay sa pag-aaral ng mga natural na compound, kabilang ang mga biopolymer. Sa pagdating ng electrospray ionization at matrix-assisted laser desorption/ionization techniques, ang mga asukal, nucleic acid, protina, lipid, at iba pang bioorganic macromolecule ay naging available para sa mass spectrometry. Walang alinlangan, ang pinakamalaking tagumpay ay nakamit sa pag-aaral ng mga protina. Dahil sa pagiging sensitibo nito, nilalaman ng impormasyon, bilis, at kakayahang magtrabaho sa mga pinaghalong, mass spectrometry ngayon ang pangunahing paraan para sa pagsusuri sa mga bagay na ito na mahirap pag-aralan.
Marahil ay makikilala na ang modernong mass spectrometry ay nanalo sa kumpetisyon sa klasikal na paraan ng pagtatatag ng pangunahing pagkakasunud-sunod ng amino acid sa mga peptides ayon kay Edman, dahil ang mass spectrometric sequencing ay naging mas mabilis, mas sensitibo, mas nagbibigay-kaalaman, at mas mura. . Mabilis at maaasahang pagpapasiya ng pangunahing istraktura ng mga protina, i.e. pagkakasunud-sunod ng mga yunit ng amino acid, sa kanyang sarili ay isang mahusay na resulta. Gayunpaman, ang mass spectrometry ay may kakayahang pag-aralan ang mga istruktura ng mas kumplikadong mga order (mula 2 hanggang 4), kabilang ang mga non-covalent na pakikipag-ugnayan ng mga protina na may hitsura ng mga superprotein formations, pagtukoy sa uri at lugar ng mga post-translational na pagbabago, nagtatrabaho sa glycoproteins, lipoproteins , phosphoproteins, atbp. Ang mass spectrometry ay naging kailangang-kailangan sa gamot, dahil ito ay mabilis at mapagkakatiwalaan na mag-diagnose ng cardiovascular, genetic at oncological na mga sakit. Ito ay ang mga tagumpay ng mass spectrometry na humantong sa pagbuo sa pagtatapos ng huling siglo ng isang bagong pang-agham na direksyon - proteomics. Ang pamamaraan ay gumaganap din ng isang mahalagang papel sa metabolismo.
Sa kasamaang palad, sa panitikan sa wikang Ruso ay wala pang mga aklat-aralin o monograp sa pinakamahalaga at multifaceted na paksa sa aplikasyon nito. Ang Russia ay lubhang nahuhuli sa mga mauunlad na bansa kapwa sa pag-aaral ng disiplinang ito at sa paggamit ng mga nagawa nito. Ang mga mass spectrometer na nagtatrabaho sa Russia ay kailangang umasa sa mga English na edisyon ng mga libro, orihinal na artikulo at review. Noong 2012, ang aklat na "Principles of mass spectrometry as applied to biomolecules" ay nai-publish sa Russian, na na-edit nina J. Laskin at H. Lifshitz (isinalin mula sa English, Publishing House "Technosfera"), na isang koleksyon ng mga artikulo ng mga nangungunang eksperto. sa larangan ng mass spectrometry sa aplikasyon sa biology. Ang libro ay inilaan para sa mga advanced na mambabasa. Nagbibigay siya
isang magandang, sa maraming aspeto, malayong pagkakataon upang maging pamilyar sa mga modernong tagumpay sa larangan ng mass spectrometry ng biomolecules, dahil ang karamihan sa mga pamamaraan na inilarawan dito ay hindi pa ginagamit sa ating bansa.
Ang aklat na "Fundamentals of Mass Spectrometry of Proteins and Peptides" na inaalok sa mga mambabasa ay ang unang aklat-aralin sa Russian na binabalangkas ang mga pangunahing kaalaman ng mass spectrometry ng mga protina at peptides. Ang aklat ay isinulat sa format ng mga lektura para sa mga nagsisimula, na inilarawan sa isang malaking bilang ng mga guhit, spectra, diagram, at sinamahan ng isang listahan ng kinatawan ng mga binanggit na panitikan. Ito ay dinisenyo para sa mga mag-aaral at nagtapos na mga mag-aaral ng kemikal, physicochemical, biological at medikal na espesyalidad; ay magiging kapaki-pakinabang sa mga mananaliksik na nagtatrabaho na sa larangan ng pananaliksik sa protina at peptide o interesado sa larangang pang-agham na ito.
Ang layunin ng paglalathala ng naturang libro ay upang mainteresan ang mga kabataang mananaliksik sa isang nagbibigay-kaalaman, napakaganda at hinihiling na disiplina sa buong mundo, upang magbigay ng pagkakataon na mas epektibong ilapat ang mass spectrometry upang malutas ang kanilang sariling mga pundamental at inilapat na mga problemang pang-agham.
Ang pokus ng aklat-aralin ay sa mga pamamaraan ng ionization ng mga protina at peptides, ang mga proseso ng fragmentation ng mga compound na ito sa gas phase. Ang mga isyu ng tandem mass spectrometry at mga umiiral na pamamaraan para sa pagsisimula ng fragmentation ay isinasaalang-alang sa sapat na detalye. Napakahalaga ng seksyong ito sa modernong mass spectrometry. Ito ay kapaki-pakinabang para sa mga mananaliksik na nagtatrabaho sa anumang mga kemikal na compound at biopolymer. Ang ilang mga kabanata ay nakatuon sa pagkakakilanlan ng mga protina at peptides. Kabilang dito ang mga opsyon para sa automated na pagkakakilanlan, manu-manong interpretasyon ng spectra, isang paglalarawan ng ilang partikular na paghihirap ng mass spectrometric sequencing at mga opsyon para sa pagtagumpayan ng mga ito. Ang mga pakinabang at disadvantage ng dalawang pangunahing diskarte sa pagtatatag ng kemikal na istraktura ng mga protina ay isinasaalang-alang: "top-down" at "bottom-up" mass spectrometry. Ang isang hiwalay na kabanata ay nakatuon sa mga katanungan ng quantitative analysis.
Ang libro ay nakatuon kina Alexander Leonidovich Kurtz at Kim Petrovich Butin, dalawang magkaibigan, magagandang propesor ng Departamento ng Chemistry sa Moscow State University na pinangalanang M.V. Lomonosov, na napakalapit sa amin sa mga termino ng tao, na direktang lumahok sa aming kemikal at humanitarian na edukasyon. Palagi naming lubos na pinahahalagahan ang chemical erudition at kamangha-manghang mga personal na katangian ng mga siyentipikong ito. Ang komunikasyon sa mga taong ito ang nagbigay inspirasyon sa amin na magsimula ng pananaliksik sa larangan ng peptide mass spectrometry sa simula pa lamang ng ika-21 siglo.
A.T. Lebedev
K.A. Artemenko
T.Yu. Samghin
480 kuskusin. | 150 UAH | $7.5 ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Thesis - 480 rubles, pagpapadala 10 minuto 24 na oras sa isang araw, pitong araw sa isang linggo at mga pista opisyal
Kaisheva Anna Leonidovna Mass-spectrometric na pagkakakilanlan ng mga protina at mga complex ng protina sa mga chips ng isang atomic force microscope: disertasyon... kandidato ng biological sciences: 03.01.04 / Kaisheva Anna Leonidovna; [Lugar ng proteksyon: Nauch.-issled. in-t biomed. kimika sa kanila. V.N. Orekhovich RAMS].- Moscow, 2010.- 104 p.: ill. RSL OD, 61 10-3/1308
Panimula
Kabanata 1 Pagsusuri sa Panitikan 10
1.1. Pagsusuri ng siyentipiko at teknikal na batayan sa larangan ng napakasensitibong mga teknolohiyang proteomic
1.2 Pagkilala sa hepatitis C virus 20
1.2.1 Paraan para sa pag-diagnose ng hepatitis C 22
1.2.2 Serological protein marker ng hepatitis C 25
Kabanata 2. Mga materyales at pamamaraan 28
2.1 ACM chips 28
2.2 Mga paghahanda at reagents ng protina 29
2.3 Pagsusuri ng AFM 30
2.4 Sample na paghahanda para sa mass spectrometric analysis 31
2.5 Pagsusuri ng mass spectrometric 33
2.5.1 MALDI-MS na pagsusuri ng mga protina sa ibabaw ng AFM chip 33
2.5.2 ESI-MS analysis ng mga protina sa ibabaw ng AFM chip 34
Kabanata 3 Mga Resulta at Talakayan 35
3.1 MS - pagkilala sa mga protina na nahuli ng "chemical fishing" sa ibabaw ng AFM chip mula sa analyte solution
3.2 MS identification ng mga protina na biospecifically nakunan sa ibabaw ng isang AFM chip mula sa isang analyte solution
3.3 MS identification ng mga protina sa ibabaw ng isang AFM chip na biospecifically nakahiwalay sa mga sample ng serum ng dugo
Konklusyon 83
Panitikan
Panimula sa trabaho
Ang kaugnayan ng gawain.
Ang isa sa mga priyoridad na lugar sa modernong biochemistry ay ang paglikha ng mga epektibong pamamaraan ng analytical para sa pagsusuri ng proteomic, ang pangunahing gawain kung saan ay upang makita at imbentaryo ang mga protina sa katawan, pag-aralan ang kanilang istraktura at pag-andar, at kilalanin ang mga pakikipag-ugnayan ng protina. Ang solusyon sa problemang ito ay magbibigay-daan sa paglikha ng mga bagong sistema para sa pag-diagnose ng mga sakit at kanilang paggamot. Ang mga karaniwang pamamaraan ng modernong pagsusuri ng proteomic ay batay sa paghihiwalay ng mga multicomponent na pinaghalong protina gamit ang chromatography, electrophoresis na pinagsama sa mga mass spectrometric na pamamaraan (MS) para sa pagkilala sa protina. Sa walang alinlangan na bentahe ng karaniwang pagsusuri ng MS sa mga tuntunin ng bilis at pagiging maaasahan ng pagkakakilanlan ng mga molekula ng protina, mayroon itong makabuluhang mga limitasyon sa aplikasyon dahil sa mababang
sensitivity ng konsentrasyon ng pagsusuri sa antas ng 10" "10" M at isang mataas na dynamic na hanay ng nilalaman ng protina sa biological na materyal. Kasabay nito, ang karamihan sa mga functional na protina, kabilang ang mga biomarker ng mga sakit na makabuluhang panlipunan tulad ng viral hepatitis B at C, mga marker ng tumor, atbp., ay naroroon sa plasma ng dugo sa mga konsentrasyon na 10" Mi mas mababa.
Ang isa sa mga paraan upang mapagtagumpayan ang metodolohikal na limitasyon ng sensitivity ng konsentrasyon ng pagsusuri ay ang paggamit ng mga biomolecular detector, na nagpapahintulot sa pagtuklas ng mga solong molekula at kanilang mga kumplikado at sa teoryang walang mga limitasyon sa pagiging sensitibo sa konsentrasyon. Kasama sa mga biomolecular detector ang mga detector batay sa mga nanotechnological device gaya ng atomic force microscopes (AFMs), nanowire detector, nanopores, at ilang iba pang detector. Ang natatanging sensitivity ng mga AFM detector ay ginagawang posible upang mailarawan ang mga indibidwal na molekula ng protina at bilangin ang kanilang bilang. Kapag gumagamit ng AFM bilang isang biomolecular detector, kinakailangan na gumamit ng mga espesyal na chips na nagpapahintulot sa konsentrasyon ng biological analyte macromolecules mula sa isang malaking dami ng incubation solution sa isang limitadong ibabaw ng chip. Ang pinag-aralan na mga bagay na protina ay maaaring nakakonsentra sa ibabaw ng chip dahil sa pisikal o kemikal na adsorption, at dahil sa mga biospecific na pakikipag-ugnayan (AFM-biospecific fishing).
Gayunpaman, sa pagsasagawa, ang limitasyon ng paggamit ng mga nanodetector na nakabatay sa AFM ay, sa kabila ng posibilidad na makita ang mga indibidwal na molekula ng protina sa ibabaw ng chip, ang mga naturang detector ay hindi matukoy ang mga ito, na lalong mahalaga sa pag-aaral ng kumplikadong protina. pinaghalong, kabilang ang biological na materyal. Samakatuwid, ang pagbuo ng isang paraan ng pagsusuri na umakma sa mga kakayahan ng pamamaraan ng AFM ay tila isang kagyat na gawain. Sa ngayon, ang tanging paraan ng proteomic na nagpapahintulot sa hindi malabo at maaasahang pagkakakilanlan ng mga molekula ng protina ay ang pagsusuri sa MS. Sa gawaing disertasyon, binuo ang isang diskarte na pinagsasama ang mataas na sensitivity ng pamamaraan ng AFM at maaasahang pagkakakilanlan ng MS para sa pagtuklas ng mga protina at kanilang mga complex mula sa isang analyte na solusyon.
Layunin at layunin ng pag-aaral.
Ang layunin ng gawaing ito ay ang mass spectrometric identification ng mga protina at mga complex ng protina na nakita sa biomaterial gamit ang atomic force microscopy.
Upang makamit ang layuning ito, nalutas ang mga sumusunod na gawain:
Isang pamamaraan para sa MS identification ng mga protina na nahuli sa ibabaw ng isang AFM chip gamit ang kemikal o biospecific na pangingisda ay binuo;
Ang mga kondisyon para sa enzymatic hydrolysis ng mga protina sa ibabaw ng isang AFM chip para sa kasunod na pagkilala sa MS ay binuo;
Ang MS-identification ng mga modelong protina sa ibabaw ng AFM chip ay isinagawa;
Ang MS-identification ng mga protina sa ibabaw ng AFM chip biospecifically isolated mula sa isang multicomponent mixture (serum) ay isinagawa.
Scientific novelty ng trabaho .
Sa disertasyon, binuo ang isang pamamaraan na nagbibigay-daan sa pagtukoy ng MS ng mga protina at mga complex ng protina na nakuha mula sa isang solusyon o isang multicomponent mixture sa ibabaw ng isang AFM chip. Para dito, napili ang pinakamainam na kondisyon para sa paghahanda ng sample, kabilang ang mode ng hydrolysis (temperatura, halumigmig, komposisyon ng pinaghalong trypsinolytic, oras ng trypsinolysis) ng mga molekula ng protina na covalently at non-covalently immobilized sa ibabaw ng AFM chip. Ang kakaiba ng gawaing ito ay, kumpara sa karaniwang mga protocol ng proteomic ng enzymatic hydrolysis, ang paghahanda ng mga sample para sa pagsusuri ng MS ay isinagawa hindi sa solusyon, ngunit sa isang limitadong lugar.
ibabaw ng chip. Ginawang posible ng binuong pamamaraan na epektibong magsagawa ng pagsusuri sa MS at tukuyin ang parehong mga indibidwal na protina at mga kumplikadong protina sa ibabaw ng AFM chip. Ang pagsusuri ng MS ng mga proteotypic peptides ng mga pinag-aralan na protina ay isinagawa gamit ang dalawang uri ng ionization (MALDI at EST) at dalawang uri ng detector (TOF at ion trap). Ang binuo na pamamaraan ng conjugation ng AFM-biospecific fishing at MS ay matagumpay ding nasubok para sa pagtuklas ng mga marker ng protina ng viral hepatitis C (HCV) (HCVcoreAg at E2) sa mga sample ng serum ng dugo.
Ang praktikal na kahalagahan ng gawain .
Ginagawang posible ng mga resulta ng gawaing ito na lumikha ng napakasensitibong pamamaraan ng proteomic nang hindi gumagamit ng mga label at karagdagang mga pamamaraan sa paghahanda ng sample para sa pagtuklas ng mga protina na nasa biological na materyal sa mababang konsentrasyon, kabilang ang serum ng dugo. Isang diskarte na batay sa atomic force microscopy at mass spectrometry ay iminungkahi, na gagawing posible upang matukoy at matukoy ang mga marker ng protina ng hepatitis C virus sa serum ng dugo ng tao.
Maaaring gamitin ang diskarte sa mga pagpapaunlad na naglalayong lumikha ng mga bagong diagnostic chip, na naghahanap ng mga biomarker ng malawak na hanay ng mga sakit na makabuluhang panlipunan.
Pag-apruba ng trabaho.
Ang mga pangunahing resulta ng pag-aaral ay ipinakita sa "1st, 2nd at 3rd International Nanotechnology Forum" (Moscow, 2008-2010); "IV Congress of the Russian Society of Biochemists and Molecular Biologists", Novosibirsk, 2008; sa International Congress "Human Proteome", Amsterdam, 2008; sa International Congress "Human Proteome", Sydney, 2010.
Mga lathalain.
Ang istraktura at saklaw ng disertasyon.
Ang disertasyon ay binubuo ng isang panimula, pagsusuri sa literatura, paglalarawan ng mga materyales at pamamaraan ng pananaliksik, mga resulta ng pananaliksik at ang kanilang talakayan, konklusyon, konklusyon at listahan ng mga sanggunian. Ang gawain ay ipinakita sa 104 na mga pahina, na may larawan na may 33 mga numero at 4 na mga talahanayan, ang listahan ng mga sanggunian ay binubuo ng 159 na mga pamagat.
Pagsusuri ng siyentipiko at teknikal na batayan sa larangan ng napakasensitibong mga teknolohiyang proteomic
Ang isa sa mga priyoridad na lugar sa modernong agham ay ang pagtuklas at pagpapaliwanag ng papel ng iba't ibang uri ng mga protina sa katawan, pati na rin ang pag-unawa sa mga mekanismo ng molekular na humahantong sa pag-unlad ng mga sakit.
Sa kabila ng patuloy na pagpapabuti sa mga pamamaraan ng proteomic, ang bilang ng mga bagong natuklasang biomarker ng sakit ay nanatiling halos 1/2 pareho sa nakalipas na dekada. Ito ay dahil sa ang katunayan na ang limitasyon ng konsentrasyon ng pagtuklas ng mga tradisyonal na pamamaraan ng proteomic ay hindi lalampas sa 10"9 M. Kasabay nito, mahalaga para sa mga proteomic na bumuo ng mga bagong analytical na diskarte para sa pagtukoy ng mga protina sa isang mas mababang hanay ng konsentrasyon, sa partikular. , mga molekulang protina na mababa ang kopya (na may konsentrasyon na 10"13 M at mas mababa), kabilang ang mga biomarker sa biological na materyal. Dahil maaaring ipagpalagay na nasa mga saklaw ng konsentrasyon na ito ang mga marker ng protina ng karamihan sa mga sakit ay matatagpuan.
Ang isa sa mga aktibong umuunlad na lugar, na ginagawang posible na bahagyang mapataas ang sensitivity ng konsentrasyon ng pagsusuri, ay ang paglikha ng mga analytical complex batay sa nanochromatographic at nanoelectrophoric system na katugma sa mass spectrometers.
Ang nanochromatographic system kasama ang mass spectrometry at electrospray type ionization ay naging posible upang mapataas ang sensitivity ng protein detection ng dalawang order ng magnitude kumpara sa high-resolution chromatography (HPLC). Ang limitasyon ng sensitivity ng konsentrasyon ng naturang conjugated system ay limitado ng sensitivity ng yugto ng electrophoresis/chromatography, at hindi lalampas sa 10-12 M para sa mga indibidwal na protina (halimbawa, para sa cytochrome C at bradykinin).
Sa kasalukuyan, ang mga pamamaraan ng chromatographic ay nabuo sa magkakahiwalay na mga independiyenteng lugar - pagsusuri ng SELDI MS (surface enhanced laser desorption at ionization/time of flight mass spectrometry), mga paraan ng pangingisda ng protina gamit ang magnetic microparticle. Sa mga teknolohiyang ito, ang hydrophobic o charged surface ng SELDI-chips ay. o magnetic microparticle, mga kumbinasyon na may mass spectrometric analysis, ay matagumpay na ginagamit: para sa? pagtuklas- at pagkakakilanlan bilang magkahiwalay na uri; protina, at para sa protina/peptide profiling ng blood serum [c, 8; \b, 15]. Ang SEbDIi МЄ ay: isang malakas na diskarte na nagpapahintulot sa iyo na pag-aralan ang isang biomaterial sa pamamagitan ng adsorption ng biomolecules (protina, peptides) sa isang chemically activated? ibabaw (cation / anion exchange chips) na sinusundan ng mass spectrometric analysis ng adsorbed: molecules:. Inilapat ang diskarte sa SEEDPMЄ; para sa profile ng protina ng biomaterial; at kamakailan lamang: ito ay ginamit bilang isang "diagnosis gamit ang proteomic barcodes" [17].. Ang kakanyahan ng naturang "barcode diagnosis" ay upang makilala? mga tampok ng profile ng protina ng biological sample; nauugnay sa isang partikular na sakit: Oo, kilala; ano d sa. cancerous na mga sakit, ang "proteomic barcode" ng biomaterial ay makabuluhang naiiba mula doon sa malusog1 grupo ng mga indibidwal: Samakatuwid, kontrolin ang mga pagbabago sa protina; Ang komposisyon ng biomaterial ay maaaring maging batayan para sa maagang pagsusuri ng mga sakit. Sa; ngayon, gamit ang SELDI approach? МЄ marker ang natukoy. gastric, ovarian, prostate, at breast cancers: Ang limitasyon ng pamamaraang ito5 ay ang kawalan ng kakayahan na tukuyin ang mga protina na may mataas na resolusyon at katumpakan, na lalong mahalaga sa; pagsusuri ng multicomponent mixtures tulad ng biological material.
Bilang karagdagan sa problema ng mababang konsentrasyon ng sensitivity ng mga umiiral na analytical system, ang isang hadlang para sa proteomic analysis ng biological na materyal ay naging isang malawak na dynamic na hanay ng mga konsentrasyon ng protina, lalo na sa serum ng dugo, na nag-iiba mula sa 1(G M hanggang sa mga indibidwal na molekula ng protina. Ang mga high-copy (major) na protina ay nakakasagabal sa mga naturang sistema ng pagtuklas at pagkilala sa mga low-copy (minor) na protina.
Ang problema ng isang malawak na hanay ng konsentrasyon ng mga protina sa isang biomaterial ay maaaring malutas sa pamamagitan ng paglalapat ng mga pamamaraan para sa pag-ubos ng serum ng dugo mula sa mga pangunahing fraction ng protina, mga pamamaraan para sa paghihiwalay ng mga multicomponent mixture at nanotechnological na pamamaraan batay sa biospecific at kemikal na pangingisda ng mga molekula ng protina ng isang analyte mula sa mga kumplikadong mixture. sa ibabaw ng chips sa iba't ibang biosensors o sa isang activated surface.magnetic microspheres.
Ayon sa kaugalian, ang one-dimensional, mas madalas na dalawang-dimensional na gel electrophoresis ay ginagamit upang paghiwalayin ang mga multicomponent na pinaghalong protina. Ang prinsipyo ng paghihiwalay ng protina sa pamamagitan ng two-dimensional na gel electrophoresis ay batay sa pagkakaiba sa pagitan ng mga protina ayon sa mga halaga ng kanilang mga isoelectric na puntos Hf ng mga timbang ng molekular. Sa proteomics, ang mga pamamaraang ito ay ginagamit para sa pagmamapa ng protina ng biomaterial (tissue, plasma ng dugo, atbp.). Ang kumbinasyon ng 1D at/o 2D electrophoresis na may mass spectrometry ay nagbibigay-daan sa pagkilala sa mga hiwalay at visualized na protina. Gayunpaman, ang pamamaraan ng dalawang-dimensional na gel electrophoresis ay hindi pa awtomatiko, sa halip ay kumplikado at tumatagal ng oras upang maisagawa, nangangailangan ng isang mataas na sanay na operator, at ang mga resulta ng pagsusuri ay kadalasang hindi nagagawang muli.
Mas maginhawa kumpara sa two-dimensional electrophoresis, ang pamamaraan para sa paghihiwalay ng mga protina ay high-performance chromatography (HPLC); na isang automated na pamamaraan na nagbibigay-daan sa iyong mag-alis ng mga high-copy na protina mula sa isang kumplikadong timpla upang kasunod na matukoy ang mga low-copy na protina.
Upang direktang makilala ang mga protina sa mga kumplikadong mixture, maaaring ikonekta ang isang chromatographic column sa isang mass spectrometer. Gayunpaman, ang mga buo na protina ay halos hindi pumapayag sa mataas na kalidad na paghihiwalay gamit ang HPLC, dahil nagde-denature sila sa panahon ng pagsusuri (dahil sa mababang halaga ng pH ng daluyan at mataas na konsentrasyon ng mga organikong solvent), at dahil din sa mababang katumpakan ng mass spectrometric. pagsusuri, samakatuwid, ang direktang pagkakakilanlan ng karamihan sa mga buo na protina, lalo na sa isang molekular na timbang na higit sa 10 kDa, ay kadalasang imposible. Ang katumpakan ng analytical na pagsukat ay maaaring mapabuti sa pamamagitan ng hydrolytic cleavage ng mga protina sa mga fragment ng peptide, molekular na timbang mula 700 hanggang 4000 Da gamit ang mga protease; tulad ng trypsin (bottom-up technology). Upang makamit ang isang husay na paghihiwalay ng mga protina sa isang halo, ang isang kumbinasyon ng ilang mga pamamaraan ng chromatographic ay ginagamit, ang tinatawag na multidimensional chromatography.
Mga pamamaraan para sa pag-diagnose ng hepatitis
Sa kasalukuyan, para sa diagnosis ng protina ng hepatitis C, ginagamit ang mga sistema ng pagsubok para sa pagtuklas ng anti-HCVcore. Ang mga unang pagsusuri sa ELISA na nakatuklas ng pagkakaroon ng mga anti-HCVcore antibodies ay naging available noong unang bahagi ng 1990s, ngunit ang mga ito ay may mababang sensitivity at selectivity. Nang maglaon, sa huling bahagi ng 1990s, lumitaw ang isang bagong henerasyon ng mga anti-HCVcore ELISA na pagsusuri, na may medyo mataas na sensitivity na humigit-kumulang 95-99% at maaaring makakita ng HCV ilang buwan pagkatapos ng impeksiyon.
Halimbawa, noong 1996, ang mga sistema ng pagsubok na binuo ng Vector-Best (Novosibirsk) at Diagnostic Systems (Nizhny Novgorod) ay lumitaw sa merkado ng Russia upang makita ang mga antibodies - anti-HCV ng klase ng IgM. Ang papel na ginagampanan ng IgM antibodies sa serodiagnosis ay hindi pa sapat na pinag-aralan, gayunpaman, ang ilang mga pag-aaral ay nagpakita ng kahalagahan ng marker na ito para sa pagtuklas ng talamak na hepatitis C. Naitatag din na ang ugnayan sa pagitan ng pagtuklas ng viral RNA at anti-HCV IgM sa mga pasyente ay 80-95%. Upang matukoy ang yugto ng pag-unlad ng viral hepatitis C Afanasyev A.Yu. gumamit ng coefficient na sumasalamin sa ratio ng anti-HCV IgG sa anti-HCV IgM sa dugo ng mga pasyente. Sa ngayon, maraming enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) system ang binuo na nakakakita ng mga nagpapalipat-lipat na antibodies sa maraming epitope ng hepatitis E virus.
Ang mga modernong diagnostic ng laboratoryo ng: viral hepatitis E sa karamihan ng mga institusyong medikal sa Moscow, ay isinasagawa; alinsunod sa umiiral na mga order ng Ministry of Health ng Russian Federation at ng Kagawaran ng Kalusugan: Moscow at upang matukoy ang mga immunoglobulin? klase G hanggang hepatitis E virus (anti-HGV IgG) sa serum ng dugo ng mga pasyente. Ang pagkakakilanlan ng marker na ito ay ginagawang posible upang hatulan ang pagkakaroon ng isang kasalukuyan o nakaraang impeksiyon.
Mga disadvantages ng mga pamamaraan; EEISA-based detection, bilang karagdagan sa mababang sensitivity (higit sa GO "12 M)j, ay dahil din sa false-detection; viral hepatitis E sa mga pasyente - dahil sa post-infectious immunity,., cross-reactivity ng antibodies, bilang pati na rin ang hindi sapat na sensitivity sa talamak na panahon) phase BFG BI LINKS: ITO ay isang aktibong paghahanap para sa sensitibo, tiyak, mabilis at madaling gawin na mga pamamaraan para sa pagtukoy ng1 mga marker ng “hepatitis E .
Isa pang grupo ng mga pamamaraan para sa pag-detect ng viral hepatitis sa suwero: blood is-B_registration, RNA BEI gamit ang PCR; Kahulugan ng RNA. Mga pamamaraan ng BFG; Ang GAD ay hindi maaaring gamitin bilang pangunahing pagsubok para sa - kumpirmasyon o pagbubukod; diagnosis; ngunit; maaaring; Kapaki-pakinabang para sa pagkumpirma ng diagnosis: Ang diagnosis ng 1 BFG ay sa pamamagitan ng pagsusuri sa 5' non-coding na rehiyon ng RNA. Gayunpaman, ang mga resulta ng pagsusuri ay nag-iiba sa iba't ibang mga genotype ng BFG.
Ang mga biological microchip ay lumitaw sa merkado ng Russia, na ginagawang posible na magsagawa ng - BFG genotyping at - matukoy ang isang epektibong antiviral scheme; therapy. Ang biochip na ito ay isang oligonucleotide chip para sa BFG genotyping batay sa pagsusuri ng rehiyon ng NS5B. Ang mga nakuhang resulta ay nagpapahiwatig ng kakayahan ng biochip na tukuyin ang lahat ng 6 na genotype ng HCV at 36 na mga subtype, kabilang ang mga pinaka-virrulent at mga form na lumalaban sa droga.
Sa isang banda, ang mga pamamaraan ng pagsusuri ng PCR ay sobrang sensitibo at nagbibigay-daan sa pag-detect at pagpapalakas ng signal mula sa isang molekula lamang ng RNA sa sample, ngunit sa kabilang banda, ang mga pamamaraang ito ay nailalarawan sa pamamagitan ng mga maling positibong resulta dahil sa random na kontaminasyon ng mga sample, mga maling negatibong resulta. dahil sa mataas na pagbabago ng virus at medyo mataas na gastos sa pagsusuri. Kahit na sa parehong tao, ang mga antas ng HCV RNA ay maaaring pana-panahong magbago ng higit sa isang millifold, na humahantong sa mga maling negatibong resulta kung mababa? pagtitiklop ng virus o kung nananatili ang virus sa mga tisyu nang hindi pumapasok sa dugo. Ang mga resulta ng quantitative determination ng RIG, HCV sa iba't ibang mga laboratoryo ay hindi masyadong sumasang-ayon.
Ang partikular na halaga para sa maagang pagtuklas ng viral hepatitis C Bt biomaterial ay ang mga antigen ng protina ng HCV dahil sa katotohanang lumilitaw ang mga ito1 sa serum ng dugo ilang linggo nang mas maaga, kahit na bago ang pagbuo ng isang ganap na immune response ng katawan.
Ang HCVcoreAg surface antigen ng hepatitis C virus ay ang pangunahing marker ng impeksyon sa hepatitis C virus. Natukoy ito 16 na linggo bago ang paglitaw ng mga antibodies sa dugo dahil sa immune response ng katawan at bago ang pagbuo ng mga klinikal na palatandaan, habang ito ay naitala kapwa sa talamak at talamak na yugto ng mga sakit. Mayroon lamang isang dayuhang komersyal na produkto (“Ortho Clinical Diagnostics”) para sa ELISA diagnostics ng hepatitis C sa panahon ng talamak na yugto, batay sa pagtuklas ng HCVcoreAg.
Ang structural protein na HCVcoreAg, na binubuo ng 121 amino acid residues, ay matatagpuan sa N-terminus ng polypeptide at nabuo sa ilalim ng impluwensya ng mga cellular protease. Ang unang proteolytic hydrolysis ay nangyayari sa pagitan ng mga nalalabi 191 at 192 (site C1) at humahantong sa pagbuo ng E1 glycoprotein. Ang pangalawang lugar ng cleavage (C2) ay nasa pagitan ng mga amino acid 174 at 191. Ang mga katumbas na produkto ng cleavage ay pinangalanang p21 at p23. Ang pagsusuri ng expression sa isang bilang ng mga mammalian cell ay nagpakita na ang p21 ang pangunahing produkto, habang ang p23 ay matatagpuan sa mga maliliit na halaga. Posible na ang cleavage sa mga site ng C1 at C2 ay isang magkakaugnay na proseso, dahil ang p21 ay nabuo sa ilalim ng mga kondisyon kapag ang hydrolysis sa G2 ay hindi sinusunod [D45]. Ang HCVcoreAg ay ang pangunahing RNA-binding protein na lumilitaw na bumubuo sa viral nucleocapsid. Ang mga biochemical na katangian ng protina na ito ay hindi pa rin nailalarawan. Ang mga pag-aaral ng AFM ng mga particle ng hepatitis C virus ay naging posible upang makakuha ng larawan ng HCV capsid.
ASM chips
Sa pang-eksperimentong bahagi ng trabaho, dalawang uri ng AFM chips ang ginamit. Ang unang uri ay ginamit para sa MS identification ng mga modelong protina sa ibabaw ng AFM chips. Ang mga chips na ito ay mga substrate na may functionally active chemical group (mula rito ay tinutukoy bilang AFM chips na may chemically activated surface), kung saan ang mga pinag-aralan na molekula ay nahuli at hindi na maibabalik dahil sa mga covalent bond, ang tinatawag na "chemical fishing" na pamamaraan. Ang pangalawang uri ng AFM chips ay ginamit para sa MS identification sa kanilang ibabaw ng mga protina na biospecifically isolated mula sa analyte solution. Ang mga biological probes ay dati nang hindi kumikilos sa ibabaw ng mga chips na ito - sa mga lugar ng pagtatrabaho. Ang mga monoclonal antibodies laban sa mga marker na protina ng viral hepatitis B at C (BFB at BFC) o aptamerr laban sa gpl20 na protina at thrombin ay ginamit bilang biological probes. Para sa biospecific-fishing procedures, ang mga chips na may covalently immobilized probe molecules ay incubated. sa % analyte na solusyon na naglalaman lamang ng mga nakikitang protina, o mga sample ng serum ng dugo
Upang maisagawa ang gawain ng MS identification ng mga modelong protina na covalently immobilized sa ibabaw ng AFM chips ng unang uri, ang mga sumusunod ay ginamit sa trabaho: avidin (Agilent, USA), HSA (Agilent, USA), P450 VMZ (mabait na ibinigay ni Propesor A.V. Munro, University of Manchester, UK), thrombin (Sigma, USA), a-FP at anti-a-FP (USBio, USA); Upang maisagawa ang gawain ng MS identification ng mga protina sa ibabaw ng AFM chips ng pangalawang uri, biospecifically isolated mula sa analyte solution, monoclonal antibodies (MABs) ay ginamit bilang probe molecules: anti-HCVcore (Virogen, USA), anti-HBVcore (Research Institute of Molecular Diagnostics, Moscow), anti-HBsAg (Aldevron, USA), bilang mga target na molekula: HBVcoreAg, HCVcoreAg (Virogen, USA) at HBsAg (Aldevron, USA), gpl20 (Sigma, USA), troponin (USBio, USA).
Bilang karagdagan, ang mga sumusunod na sangkap ay ginamit sa trabaho: acetonitrile, isopropanol, formic acid, distilled water (Merck, USA), trifluoroacetic acid (TFA), ammonium bicarbonate (Sigma, USA), a-cyano-4-hydroxycinnamic acid ( HCCA), dihydroxybenzoic acid-(DHB) (Bruker Daltonics, Germany), trypsin (Promega, USA).
Ang mga sample ng blood serum para sa pag-aaral ng AFM ay ibinigay ng Department of Infectious Diseases in Children ng Russian State Medical University, Central Research Institute of Epidemiology ng Rospotrebnadzor, MNIIEM "n. Gabrichevsky: Ang pagkakaroon ng mga particle ng hepatitis C virus (HCV) sa serum ng dugo nakumpirma ang mga sample gamit ang polymerase (chain reaction (PCR) method) gamit ang test system na "Amplisens HCV Monitor" (Central Research Institute of Epidemiology ng Ministry of Health ng Russian Federation, Moscow).
Ang pagsusuri sa AFM ay isinagawa sa Laboratory of Nanobiotechnology, IBMC RAMS. Ang pagkalkula ng mga protina at antigen/antibody complex sa ibabaw ng AFM chip ay isinagawa batay sa ugnayan ng mga taas ng kaukulang mga larawan ng mga protina at kanilang mga complex, na sinusukat gamit ang AFM, ayon sa pamamaraang inilarawan sa . Ginamit ng ACM NTEGRA (NT-MDT, Russia). Ang mga sukat ng AFM ay isinagawa sa semi-contact mode. Ang NSG10 series cantilevers mula sa NT-MDT ay ginamit bilang probes. Ang karaniwang radius ng curvature ng mga karayom ay 10 nm, at ang resonant frequency ay mula 190 hanggang 325 kHz. Ang lugar ng pag-scan ng chip ay 400 µm2. Ang bawat pagsukat ay isinagawa nang hindi bababa sa 3 beses.
Ang immobilization ng mga protina at aptamer sa ibabaw ng AFM chip ay isinagawa ayon sa sumusunod na pamamaraan.
Sa isang solusyon ng protina (0.1 µM) na may dami ng 2 µl ay idinagdag ang 8 µl ng isang solusyon ng isang pinaghalong NHS/EDC (v/v=l/l) at lubusang pinaghalo. Ang nagresultang timpla ay inilapat sa ibabaw ng silanized chip at incubated para sa 2 minuto sa temperatura ng kuwarto. Ang chip ay pagkatapos ay hugasan ng dalawang beses sa isang thermoshaker na may 1 ml ng deionized na tubig sa 800 rpm at 37 ° C. Ang kalidad ng immobilization ng protina sa ibabaw ng AFM chip ay sinusubaybayan ng atomic force microscopy.
Ang immobilization ng mga aptamer sa chemically activated surface ng AEM chip ay isinagawa bilang mga sumusunod. Sa isang stock solution ng DSP sa konsentrasyon na 1.2 mM sa DMSO/ethanol (v/v=l/l)4 ay idinagdag ang solusyon ng PBS buffer 50 mM (pH 7.4) din sa ratio na 1/1 sa dami. Ang gumaganang solusyon kaya nakuha ay inilapat sa ibabaw ng AFM chip at incubated para sa 10 minuto. Pagkatapos nito, ang paghuhugas ay isinasagawa gamit ang isang 50% na solusyon ng ethanol sa tubig na may dami ng 1 ml sa 15C sa loob ng 10 minuto. Ang isang solusyon ng aptamer na may konsentrasyon ng 3 JIM ay inilapat sa activated zone ng AFM chip at natupok sa loob ng 4 na minuto na may pagpapakilos sa bilis na 800 rpm. Ang pagharang ng mga unreacted amino group ng DSP cross-linker ay isinasagawa sa pagkakaroon ng 5 mM Tris-HCl solution sa loob ng 10 minuto sa 37 ° C. Ang huling hakbang sa paghuhugas ay isinagawa ng dalawang beses na may 1 ml na may tubig na solusyon sa loob ng 10 minuto sa 25°C.
Isang trypsinolytic mixture na naglalaman ng buffer solution na 150 mM NH4HCO3, acetonitrile, 0.5 M guanidine hydrochloride, at glycerol (pH 7.4) ay inilapat sa ibabaw ng AFM chip na may mga immobilized probe molecule. Pagkatapos, 0.5 μl ng binagong porcine trypsin solution sa isang konsentrasyon na 0.1 μM ay idinagdag sa buffer solution. Ang AFM chip ay incubated sa isang mahalumigmig na kapaligiran para sa 2 oras sa isang pare-parehong temperatura ng 45C, 0.5 μl ng trypsin solution (0.1 μM) ay muling idinagdag sa ibabaw nito, at ang pagpapapisa ng itlog ay nagpatuloy para sa isa pang 12 oras. Ang pinaghalong trypsinolytic ay hugasan sa ibabaw ng AFM chip na may 10 µl elution solution na naglalaman ng 70% acetonitrile sa 0.7% trifluoroacetic acid (TFA). Ang hydrolyzate na nakuha mula sa ibabaw ng AFM chip ay natuyo sa isang vacuum evaporator sa 45 ° C at 4200 rpm. Susunod, ang peptide mixture ay natunaw sa 10 µl ng isang 5% formic acid solution o sa 10 µl ng isang 0.7% TFA solution para sa kasunod na pagsusuri ng MS.
Sa panahon ng pagsusuri ng MS kasama ang uri ng ionization ng MALDI, ang mga sample ay inihanda tulad ng sumusunod. Ang mga sample na natunaw sa 0.7% TFA solution na may volume na 10 µl ay puro at desalted gamit ang ZipTip C18 microtips (Millipore, USA) ayon sa protocol ng manufacturer at hinaluan ng saturated solution ng isang matrix na naglalaman ng HCCA o DHB sa 50% acetonitrile solution na may 0 .7% TFA. Ang nagresultang timpla ay inilapat sa isang MTP size na target na MALDI.
-pagtukoy ng mga protina na nahuli ng "chemical fishing" sa ibabaw ng isang AFM chip mula sa isang analyte solution
Sa yugtong ito ng eksperimentong gawain, ang MS spectra ay nakuha para sa mga modelong protina na chemically immobilized sa ibabaw ng AFM chips mula sa isang analyte solution. Ang hanay ng mga konsentrasyon ng mga pinag-aralan na protina sa analyte solution para sa avidin, HSA, anti-aFP ay 10"-10"9 M, troponin, aFP at P450 VMZ - 10"6-10"8 M.
Ang pagsusuri sa MS ay isinagawa para sa 6 na uri ng mga protina, naiiba sa kanilang pinagmulan, molekular na timbang, ang bilang ng mga site ng trypsinolysis at ang kanilang spatial accessibility, ang antas ng hydrophobicity ng pagkakasunud-sunod ng amino acid (ang ratio ng hydrophobic amino acid sa hydrophilic), na covalently immobilized sa ibabaw ng AFM chip mula sa analyte solution (Talahanayan 1). Sa mga eksperimentong ito, ginamit ang mga AFM chip, na naglalaman ng mga working at control zone. Ang working zone ay isang chemically activated area ng AFM chip surface, kung saan ang mga modelong protina ay "chemically fished"; ang control zone ay ang chemically inactive na rehiyon ng ibabaw ng chip. Ang bilang ng mga visualized na nakunan na molekula ay naitala gamit ang AFM. Ang pang-eksperimentong data ng pagsusuri ng AFM na nakuha para sa mga protina ng modelo sa itaas, katulad ng bilang ng mga molekula na nahuli sa ibabaw ng working zone ng AFM chip, ay ipinakita sa Talahanayan 2. protina sa analyte solution.
Tulad ng makikita mula sa Talahanayan 2, ang bilang ng mga molekula na nakarehistro sa lugar ng pagtatrabaho ng AFM chip para sa lahat ng ipinakita na mga protina ay -1040 na mga molekula. Ang limitasyon sa pagiging sensitibo ng mga MS detector ay humigit-kumulang 105 molecule. Kaya, para sa ipinakita na mga protina ng modelo, ang matagumpay na hindi maibabalik na immobilization ay isinagawa sa ibabaw ng AFM chip, at ang bilang ng mga bagay na protina na nakarehistro sa AFM ay sapat para sa kasunod na pagkakakilanlan ng MS. Kasabay nito, ang pinakamababang naitalang konsentrasyon ng mga modelong protina sa incubation solution ay medyo mababa, 10"-10" M.
Ang mass spectrometric analysis ng mga sample ay isinagawa gamit ang MALDI at ESI na mga uri ng ionization. AFM chip pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog sa naaangkop na solusyon ng avidin na may konsentrasyon na 10"9 M. Ang pagsusuri sa mga spectra na ito ay naging posible upang mapagkakatiwalaang makilala ang avidin (Gallus Gallus) sa pamamagitan ng dalawang proteotypic peptides nito: SSVNDIGDDWK (m/z=618.6) at VGINIFTR (m/z= 460.4). Parehong peptides ay may mahusay na tinukoy na mga taluktok ng kanilang dobleng sisingilin na mga ion (MS spectra). Gamit ang AFM-MS analysis ng chemically activated working zone ng AFM chip pagkatapos ng incubation sa isang solusyon ng analyte protein na may isang konsentrasyon ng 10"8 M, isa pang maliit na protina ang nakita - troponin I. Ang MS at MS/MS spectra na naaayon sa peptide na doble ang sisingilin na ion 1449 Da ay ipinapakita sa Figure 3. Ang MS analysis ng spectra na nakuha sa eksperimental ay naging posible upang mapagkakatiwalaang kilalanin at kilalanin ang troponin ng tao (gi 2460249) sa ibabaw ng AFM chip na may posibilidad na higit sa 95% .
Ipinapakita ng Figure 5 ang tandem fragmentation spectra ng isang globular protein, human serum albumin (HSA), na gumaganap ng mga transport function sa plasma ng dugo. Ang spectra ay nakuha mula sa chemically activated working area ng AFM chip pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog sa isang naaangkop na solusyon sa albumin na may konsentrasyon na 10"9 M. Ang pagsusuri sa spectra na ito ay naging posible upang mapagkakatiwalaang makilala ang albumin ng tao sa pamamagitan ng dalawang proteotypic peptides nito: VPQVSTPTLVEVSR (m/z=756.5) at YLYEIAR (m/z=464.3) Ang parehong mga peptide ay may mahusay na tinukoy na mga taluktok ng kanilang dobleng sisingilin na mga ion (MS spectra).
MS/MS spectra ng trypsinized na mga bagay mula sa chemically activated surface ng AFM chip na incubated sa isang solusyon ng human serum albumin (C=10 9 M). VPQVSTPTLVEVSR peptide na may m/z=756.5 (A), YLYEIAR peptide na may m/z=464.3 (B). Mga kundisyong pang-eksperimento: isinagawa ang mga pagsukat sa isang LC/MSD Trap XCT Ultra mass spectrometer (Agilent).
Kaya, ginawang posible ng pagsusuri ng MS na makilala ang mga protina na nakita gamit ang AFM. Batay sa data na nakuha, ang isang relasyon ay ipinahayag sa pagitan ng bilang ng mga natukoy na proteotypic peptides sa ibabaw ng AFM chip at ang nilalaman ng nais na protina sa analyte solution. Ang ganitong pag-asa, halimbawa, para sa mga P450 na protina na VMZ at HSA, na covalently immobilized sa chemically activated surface ng AFM chip, ay ipinapakita sa Figure 6. Tulad ng makikita sa Figure 6, mas mataas ang konsentrasyon ng protina sa analyte solution (- KG6 M), mas malaki ang bilang ng mga peptide ay maaaring mapagkakatiwalaang matukoy kapwa sa kaso ng pagsusuri ng MALDI-MS at ESI-MS. Ang mga makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng bilang ng mga natukoy na peptide sa hanay ng konsentrasyon na 10"6-10"9 M sa mga nasuri na protina sa solusyon ng analyte ay hindi naobserbahan.
Dependences ng bilang ng mga natukoy na peptides ng analyte molecules sa konsentrasyon ng protina sa incubation solution. (A) - pagsusuri ng isang pinaghalong peptides ng mga modelo ng protina HSA, VMZ sa mass spectrometers na may MALDI-type ionization Bruker Microflex (Bruker Daltonics, Germany) at Autoflex III (Bruker Daltonics, Germany); (B) - pagsusuri ng pinaghalong peptides ng mga modelong protina HSA, VMZ sa isang mass spectrometer na may ESI-type na ionization LC/MSD Trap XCT Ultra (Agilent, USA).
Ang mga resulta na nakuha ay naging posible upang tapusin na ang AFM-MS (MALDI at ESI) ay ginagawang posible na makita at matukoy ang mga molekula ng protina na covalently na nakuha mula sa analyte solution sa ibabaw ng AFM chip, na naiiba sa kanilang mga katangian ng physicochemical.
Kasabay nito, sa control zone ng AFM chip (non-activated) pagkatapos ng pagpapapisa nito sa analyte solution, hindi nakita ng pamamaraang AFM ang presensya sa ibabaw ng chip ng mga bagay na tumutugma sa taas sa mga molekula ng protina. Ang pagsusuri sa MS ay hindi rin nagbubunyag ng mga bagay na may likas na protina. Kaya, pinatunayan ng eksperimento na ang AFM ay sapat na nagrerehistro ng mga nais na bagay - mga molekula ng protina ng analyte.
Ang susunod na yugto ng gawaing ito ay ang pagbuo ng isang scheme ng kumbinasyon ng AFM-MS para sa pagkilala ng mga protina na nakuhang muli mula sa isang solusyon ng za. sa pamamagitan ng biospecific na pakikipag-ugnayan.
Ang pamamaraan ng mass spectrometric analysis sa kaso ng biospecific AFM na pangingisda ng mga protina mula sa isang solusyon ay ipinapakita sa Figure 7. Ayon sa scheme sa itaas, ang mga molekula ng probe ay unang na-immobilized sa ibabaw ng working area ng AFM chips, na kung saan ay monoclonal1 antibodies laban sa mga marker ng protina ng viral hepatitis B at C o mga aptamer laban sa mga protina ng HIV-1 glycoprotein gpl20 at thrombin, habang ang ibabaw ng control zone ay hindi naglalaman ng immobilized probe molecules. Ang kontrol sa kalidad ng immobilization ng mga molekula ng probe ay isinagawa ng AGM-visualization. Pagkatapos, ang naturang chip ay natupok sa isang analyte solution na naglalaman ng protina sa ilalim ng pag-aaral. Matapos ang yugto ng paghuhugas ng mga nonspecifically adsorbed na molekula sa ibabaw ng chip, at ang yugto ng paghahanda ng sample para sa kasunod na pagsusuri ng mass spectrometric sa ibabaw ng AFM chip, isinagawa ang pagsusuri ng MS ng mga protina na nakarehistro sa AFM.
Ang pang-eksperimentong bahagi ng seksyong ito ay nagsasangkot ng dalawang yugto ng pagsusuri. Sa unang yugto, kinakailangan na isakatuparan ang MS identification ng mga molekula ng probe ng protina na covalently immobilized sa AFM chip, sa pangalawang yugto, ang mga target na protina na nakuha sa kaukulang mga molekula ng kasosyo mula sa solusyon o mula sa mga sample ng serum ng dugo dahil sa mga biospecific na pakikipag-ugnayan. Para sa layuning ito, ang MS analysis ng MCA ay covalently immobilized sa ibabaw ng AFM chips laban sa HCV at HBV marker proteins: anti-HCVcore at anti-HBVcore ay isinagawa. Para sa mga mAb laban sa mga anti-HCVcore at anti-HBVcore na protina, ang tandem fragmentation spectra at peptide map spectra ay nakuha sa gawaing ito sa unang pagkakataon.
2. REVIEW NG PANITIKAN.
2.1 Mass spectrometry sa proteomics.
2.1.1 Pangkalahatang mga prinsipyo.
2.1.2 Proteomic analysis gamit ang mass spectrometry.
2.1.3 Pagkilala ng mga protina sa pamamagitan ng paraan ng peptide mass imprint.
2.1.4 Pagkilala sa protina sa pamamagitan ng peptide fragmentation fingerprinting.
2.2 Interpretasyon ng mga resulta ng mass-spectrometric na pagkakakilanlan ng mga protina.
2.2.1 Pagtukoy sa listahan ng mga natukoy na protina.
2.2.2 Pagkilala sa mga highly homologous na protina.
2.2.3 Mga database ng mga sequence ng amino acid ng protina.
2.3 Pagsusuri ng mass spectrometric ng mga produkto ng solong gene.
2.3.1 Proteotyping at proteomic ng populasyon.
2.3.2 Pagkilala sa microheterogeneity ng protina gamit ang top-down na pamamaraan.
2.3.3 Pagkilala sa genetically determined protein polymorphism sa pamamagitan ng "bottom-up" na paraan.
2.3.4 Mga database ng protina at gene polymorphism.
2.3.5 Mass spectrometric data repository.
3 MGA MATERYAL AT PARAAN.
3.1 Mga Materyales.
3.1.1 Data ng mass spectrometry para sa mga protina ng microsomal fraction ng atay ng tao.
3.1.2 Control set ng mass spectra "Aurum Dataset".
3.1.3 Data ng mass spectrometry mula sa PRIDE proteomic repository.
3.1.4 Mga database ng mga sequence ng amino acid ng mga protina ng tao.
3.1.5 Data sa mga posibleng polymorphism ng protina ng tao.
3.2 Mga Paraan.
3.2.1 Web server para sa pagkilala sa protina sa pamamagitan ng mass spectra.
3.2.2 Batch processing ng mass spectra gamit ang peptide mass imprint method.
3.2.3 Batch processing ng tandem mass spectra.
3.2.4 One-dimensional na proteomic mapping.
3.2.5 Pagpapatupad ng software ng umuulit na algorithm para sa pagtukoy sa SAP.
3.2.6 Pagpapatunay ng algorithm ng pagkakakilanlan ng SAP.
4 RESULTA AT TALAKAYAN.
4.1 Pagtaas ng saklaw ng mga pagkakasunud-sunod ng amino acid sa pamamagitan ng mga natukoy na peptide.
4.1.1 Pagkilala ng mga protina sa mga seksyon ng gel.
4.1.2 One-dimensional na proteomic na mga mapa at ang kanilang mga katangian.
4.1.3 Pag-detect ng mga homologous na protina ng superfamily ng cytochrome P450 sa pamamagitan ng pagtaas ng saklaw ng mga pagkakasunud-sunod ng amino acid sa pamamagitan ng mga natukoy na peptide.
4.2 Pagkilala ng PDA sa mga protina ng cytochrome P450 superfamily.
4.3 Algoritmo ng pagkakakilanlan ng SDA.
4.3.1 Iterative scheme para sa pagproseso ng tandem mass spectra.
4.3.2 Sensitivity at specificity ng SDA identification algorithm.
4.4 Application ng isang umuulit na algorithm para sa pagtuklas ng PDA sa mass spectrometric data ng PRIDE proteomic repository.
4.4.1 Paunang data na ginamit upang makilala ang PDA.
4.4.2 Pagkilala sa mga peptide at protina gamit ang mass spectrometric data na na-download mula sa imbakan ng PRIDE.
4.4.3 Pagkilala sa mga single amino acid polymorphism.
4.5 Pagsusuri ng mga natukoy na PDA.
4.5.1 Pagsusuri ng mga peptide na naglalaman ng PDA.
4.5.2 Samahan ng mga natukoy na PDA na may mga sakit ng tao.
Inirerekomendang listahan ng mga disertasyon
Post-translational na regulasyon ng cytochromes P450 subfamily 2B 2013, Doktor ng Biological Sciences Zgoda, Victor Gavrilovich
Mass spectrometric determination ng aktibidad at nilalaman ng cytochromes P450 2013, kandidato ng biological sciences Moskaleva, Natalya Evgenievna
Structural at functional na pagmamapa ng mga protina ng cytochrome P450-containing monooxygenase system 2002, Doktor ng Biological Sciences Kolesanova, Ekaterina Fedorovna
Paraan para sa Pagkilala sa Mga Pagkakasunud-sunod ng Amino Acid sa Peptide Mass Spectra para sa Mga Problema ng Proteomics 2007, kandidato ng teknikal na agham Lyutvinsky, Yaroslav Igorevich
Universal Scale ng Chromatographic Retention Times ng Biomacromolecules sa mga Problema ng "Quick-Fire" Proteomics 2011, Kandidato ng Physical and Mathematical Sciences Prydatchenko, Marina Leonidovna
Panimula sa thesis (bahagi ng abstract) sa paksang "Pagsusuri ng mass spectra ng mga fragment ng peptide para sa pagkakakilanlan ng genetically determined protein polymorphism"
Ang database ng Ensembl ay naglalaman ng impormasyon sa 20,469 coding genes batay sa mga resulta ng pagpupulong ng genome ng tao na ginanap sa US National Center for Biotechnology Information (Pebrero 2009). Ang isang maliit na bilang ng mga gene ay nagpapahintulot sa amin na tapusin na ang pagiging kumplikado ng mga buhay na sistema ay nakakamit sa antas ng regulasyon ng transkripsyon, pagsasalin, at mga pagbabago sa post-translational. Ang alternatibong splicing at mga pagbabago tulad ng phosphorylation at glycosylation, kasama ang pagpoproseso ng proteolytic, ay humantong sa pagbuo ng iba't ibang mga protina, na ang bilang ay lumampas sa bilang ng mga gene sa ilang mga order ng magnitude. Ang mga pagtatantya na isinagawa sa pamamagitan ng iba't ibang mga pamamaraan ay nagpapakita na ang proteome ng tao ay maaaring magsama ng ilang milyong mga protina na naiiba sa kanilang kemikal na istraktura.
Ang tradisyonal na diskarte sa pag-aaral ng proteome ay batay sa paggamit ng immunohistochemical staining ng mga seksyon ng tissue. Ang unang bersyon ng human proteomic atlas ay binuo gamit ang mga antibodies. Ang paggamit ng mga biological microchip na naglalaman ng mga antibodies na idineposito sa mga ito ay ginagawang posible upang matukoy at mabilang ang hanggang sa ilang daang mga protina sa isang sample. Gayunpaman, ang diskarte na ito ay may mga limitasyon, na nauugnay sa pangangailangan na bumuo at i-verify ang mga antibodies, hindi sapat na pagtitiyak dahil sa mga pakikipag-ugnayan sa krus, at medyo mababa ang pagkakaugnay ng mga antigen-antibody complex. Sa pagsasaalang-alang na ito, ang isang mas unibersal at hindi nangangailangan ng immunospecific reagents na paraan ng pagkilala sa protina, biological mass spectrometry, ay naging partikular na kahalagahan para sa pag-aaral ng proteome.
Sa mass spectrometric analysis ng isang biomaterial, ang pagkilala sa mga molekula ng protina ay isinasagawa sa pamamagitan ng paghahambing ng sinusukat na mass-charging na mga katangian ng mga protina at/o ang kanilang mga proteolytic fragment na may mga teoretikal na halaga na kinakalkula batay sa mga pagkakasunud-sunod ng amino acid na naka-encode sa genome . Dapat itong isaalang-alang na ang pagkakasunud-sunod ng genome ay hindi tahasang naglalaman ng impormasyon tungkol sa mga alternatibong site ng splicing at posibleng mga pagbabago sa post-translational. Ang pagkakakilanlan ng mga kaso ng alternatibong splicing ay posible batay sa pang-eksperimentong data: ang mapagkukunan ng impormasyon tungkol sa mga splice isoform ay ang mga database ng coding DNA. Ang pagtuklas ng mga post-translational na pagbabago ay isinasagawa gamit ang high-precision mass spectrometry ng mga protina o gamit ang tandem mass spectrometry ng mga fragment ng peptide
Kasama ng alternatibong splicing at post-translational modification, tumataas ang pagkakaiba-iba ng mga molekula ng protina dahil sa pagsasalin ng mga hindi magkasingkahulugan na single nucleotide polymorphism (non-synonymous Single Nucleotide Polymorphism, nsSNP). Ang pagtatatag ng pagkakaroon ng mga nsSNP ay isinasagawa gamit ang genotyping, habang ang kumpirmasyon ng pagkakaroon ng kaukulang pagpapalit ng nalalabi sa pangunahing istraktura ng protina, ibig sabihin, ang pagkakakilanlan ng mga single amino acid polymorphism (SAP, Single Amino Acid Polymorphism, SAP), ay tumutukoy sa ang mga gawain ng proteotyping.
Ang kahalagahan ng pagtukoy at pag-aaral ng alternatibong splicing, PDA, at post-translational na mga pagbabago sa antas ng protina ay dahil sa impluwensya ng mga prosesong ito sa antas ng pagpapahayag at functional na katangian ng mga protina. Alam na ang pagbabago sa antas ng aktibidad o pagpapahayag ng mga protina ay maaaring humantong sa paglitaw at pag-unlad ng mga sakit na makabuluhang panlipunan, kabilang ang mga sakit na oncological, cardiovascular, at neurodegenerative.
Ang pagkakaroon ng humigit-kumulang 65 libong hindi magkasingkahulugan na polymorphism, na ipinapalagay na isinalin sa PDA, ay naitatag sa genome, at higit sa 30% marahil ay humantong sa isang pagbabago sa mga functional na katangian ng mga protina. Dahil ang pagbabago sa aktibidad ng protina ay nauugnay sa pag-unlad ng mga sakit, ang mga pag-aaral ng PDA ay kinakailangan upang matukoy ang mga sanhi ng istruktura na pinagbabatayan ng naobserbahang mga functional disorder. Ang mga gawain ng proteotyping ay kinabibilangan ng husay at dami ng pagpapasiya ng pagpapahayag ng mga allelic na variant ng mga gene sa antas ng proteomic, pati na rin ang pagsubaybay sa dalas ng paglitaw ng mga ipinahayag na allelic na variant ng mga protina sa antas ng populasyon.
Ang pagkakakilanlan ng PDA sa isang high-throughput mode gamit ang mass spectrometry ay nauugnay sa mga teknikal na limitasyon. Para sa gawain ng proteotyping, ang pinaka-sapat na diskarte ay ang "top-down", iyon ay, mass spectrometry ng mga buo na protina (sa halip na ang kanilang mga fragment). Gayunpaman, ang sensitivity ng diskarte na ito ay mababa, sa antas ng 10h-10 5 M. Bilang resulta, ang pagkakakilanlan ng sampu, mas madalas daan-daan, at, sa mga pambihirang kaso lamang, hanggang sa isang libong protina ay ibinigay. Kadalasan sa biological mass spectrometry, isa pang diskarte ang ginagamit - "bottom-up", kung saan ang pagkakaroon ng isang protina sa isang sample ay natutukoy sa pamamagitan ng pagtukoy sa mga proteolytic fragment nito (peptides). Sa karamihan ng mga kaso, ang isang maliit na halaga ng mga peptides ay sapat upang makilala ang isang protina, na kung saan magkasama ay maaaring bumubuo ng hindi hihigit sa 5% ng biopolymer sequence. Para sa natitirang pagkakasunud-sunod ng amino acid ng protina, imposibleng maitatag ang presensya/kawalan ng mga kemikal na pagbabago ng mga residue ng amino acid o polymorphism ng amino acid.
Upang matukoy ang solong amino acid polymorphism ng mga protina ng tao gamit ang biological mass spectrometry, kinakailangan upang madagdagan ang saklaw ng pagkakasunud-sunod ng protina amino acid sa pamamagitan ng pagtukoy ng mga karagdagang proteolytic peptides ng protina. Posible ito bilang resulta ng pagsasagawa ng eksperimento na may malaking bilang ng bahagyang o ganap na paulit-ulit na mass spectrometric analysis. Bilang karagdagan, ang data mula sa mga proteomic na eksperimento na isinagawa ng maraming pangkat ng pananaliksik ay maaaring pagsamahin sa loob ng isang pag-aaral. Ang pag-access sa isang malawak na koleksyon ng mass spectra ay ibinibigay ng iba't ibang proteomic repository, ang pinakasikat kung saan - PRIDE (Protein Identification Database) - nag-iimbak ng mga resulta ng higit sa 13 libong proteomic na mga eksperimento. Kung mas mataas ang antas ng saklaw ng pagkakasunud-sunod ng amino acid ng protina ng mga natukoy na peptides, mas malamang na kumpirmahin ang pagkakaroon o kawalan ng solong pagpapalit ng amino acid sa istraktura ng protina.
Sa pagkakaroon ng isang malawak na halaga ng mass spectrometric data, ang solusyon ng problema ng proteotyping ay posible sa pamamagitan ng paggamit ng mga computational na pamamaraan ng bioinformatics. Halimbawa, maaaring isagawa ang pagsusuri ng mass spectrometric data gamit ang mga expressed fragment database (EST), na naglalaman ng impormasyon tungkol sa mga isinaling variant ng hindi magkasingkahulugan na mga polymorphism ng gene. Ang pangalawang paraan, na ipinatupad sa maraming mga programa sa pagkilala sa protina, ay isang paghahambing ng mass spectra na may isang database ng mga teoretikal na pagkakasunud-sunod ng protina, na nagpapahintulot sa mga kamalian sa anyo ng mga pamalit na nalalabi sa amino acid.
Ang mga disadvantages ng mga diskarte sa itaas ay kilala. Ang mga naipahayag na database ng fragment ay naglalaman ng kalabisan na impormasyon, kabilang ang mga error sa sequencing, na nagpapalubha sa pagsusuri ng mga resulta ng mass spectrometry. Kapag sinusuri ang isang sample kung saan ilang daang protina ang natukoy, ang resultang mass spectra ay dapat ikumpara sa daan-daang libong mga transcript na naipon sa mga dekada, na naglalaman ng higit sa 5% na mga error. Kapag sinusuri ang mass spectra na may pag-aakalang posibleng mga kamalian sa database, ang impormasyon tungkol sa totoong buhay na hindi magkasingkahulugan na mga pagpapalit na itinatag sa pamamagitan ng genotyping ay binabalewala. Ang mga artipisyal na pagpapalagay na ipinakilala sa database o algorithm ng pagkakakilanlan ng protina ay humantong sa pagbaba sa pagiging maaasahan ng mga resulta. Ang mga pagkukulang na ito ng mga umiiral na pamamaraan ng proteotyping ay nangangailangan ng pagpapabuti ng mga computational approach sa pagkakakilanlan ng PDA.
Ang layunin ng gawain ay upang bumuo ng isang paraan para sa pagsusuri ng mass spectrometric data upang makilala ang mga solong amino acid polymorphism na nagreresulta mula sa pagsasalin ng mga nonsynonymous na mga pagpapalit ng nucleotide sa kaukulang mga gene, at upang gamitin ang binuo na pamamaraan upang makita ang mga pagpapalit ng amino acid sa mga protina ng tao. Upang makamit ang layunin, ang mga sumusunod na gawain ay nalutas:
1. Iproseso ang mass spectra ng mga fragment ng peptide upang mapataas ang antas ng saklaw ng mga sequence ng amino acid ng protina sa pamamagitan ng mga natukoy na peptides.
2. Gamit ang isang model set ng mass spectrometric data na nagbibigay ng mataas na antas ng sequence coverage, bumuo ng isang paraan para sa pag-detect ng solong amino acid substitutions sa mga protina ng tao.
3. I-generalize ang paraan para sa pag-detect ng solong amino acid substitutions sa anyo ng isang unibersal na algorithm para sa pagproseso ng tandem mass spectra; suriin ang sensitivity at specificity ng ginawang algorithm.
4. Ilapat ang nilikhang algorithm para sa pagpoproseso ng repository ng mass spectrometric data, tukuyin ang mga solong amino acid polymorphism at tukuyin ang mga protina ng tao na naglalaman ng mga natukoy na polymorphism.
2. REVIEW NG PANITIKAN
Ang terminong "proteome" - ang kumpletong hanay ng mga protina na ipinahayag sa katawan - ay unang iminungkahi ni Mark Wilkins na may kaugnayan sa pangangailangang dagdagan ang kaalaman tungkol sa mga genome na may kaugnay na impormasyon tungkol sa mga protina na naka-encode sa kanila. Ang object ng pag-aaral sa pagsusuri ng proteome ay maaaring pareho ang buong organismo at ang cellular component, tissue, subcellular structure, halimbawa, ang nucleus, microsomal fraction, atbp.
Ang mga resulta ng isang malakihang imbentaryo ng mga protina gamit ang mass spectrometry ay nai-publish sa gawain ni Shevchenko et al. noong 1996. Ang pagdating ng biological mass spectrometry ay minarkahan ang pagdating ng panahon ng mga high-performance post-genomic na teknolohiya, na ginagawang posible na makakuha ng impormasyon tungkol sa mga gene at protina sa sukat ng buong organismo bilang resulta ng isang eksperimento. Bilang karagdagan sa proteomics, kasama rin sa mga teknolohiyang postgenomic ang genomics at transcriptomics. Kapag sinusuri ang genetic na materyal, ginagawang posible ng mga teknolohiyang post-genomic na maitaguyod ang pagkakaroon ng gene polymorphism gamit ang buong genome re-sequencing o high-density na pagmamapa ng mga single nucleotide substitutions (SNPs).
Ang mga kasalukuyang diskarte sa pag-aaral ng pagkakaiba-iba ng protina ay maaaring hatiin sa dalawang lugar. Sa unang kaso, bago i-set up ang eksperimento, paunang natukoy kung aling mga molekula ng protina ang binalak na matukoy. Sa pamamaraang ito, ang pagkilala sa mga protina ay isinasagawa gamit ang mga antibodies na ginagamit para sa histochemical staining ng mga seksyon ng tissue, na sinusundan ng mga microphotograph ng mga cell. Sa micrograph ng seksyon, ang mga fluorescent na lugar ay tumutugma sa mga lokalisasyon na site ng nakitang protina-antigen, at ang intensity ng fluorescence ay ginagawang posible upang mabilang ang nilalaman ng protina na ito.
Bilang bahagi ng malaking internasyonal na proyekto ng ProteinAtlas, ang isang malakihang produksyon ng mga antibodies sa mga protina ng lahat ng mga gene ng tao ay isinasagawa. Mahigit sa 400,000 micrographs ng immunohistochemically stained sections ng halos lahat ng tissue ng tao ang nakuha at ginawang available para sa pampublikong paggamit sa panahon ng proyektong ito. Ang paghahambing na pagsusuri ng pamamahagi ng tiyak na kulay ng mga protina ay naging posible, sa partikular, upang ipakita ang mga katangian ng profile ng pagpapahayag ng protina para sa mga tisyu ng kanser. Gayunpaman, ang paglamlam ng mga seksyon ng tissue gamit ang mga fluorescently na may label na antibodies ay isang medyo krudo na paraan para sa pag-aaral ng proteome. Una, gaya ng itinuturo mismo ng mga nag-develop ng proyektong ProteinAtlas, ang kalidad ng maraming mga antibodies na magagamit sa komersyo ay napakababa. Humigit-kumulang kalahati ng biniling antibodies sa panahon ng pag-verify ay nagpapakita ng mababang pagtitiyak para sa pinag-aralan na antigen, at ang mga paghahanda ng antibody ay kadalasang nailalarawan sa mababang kadalisayan. Pangalawa, ang isang malaking bilang ng mga antigen-antibody complex ay nailalarawan sa pamamagitan ng isang dissociation constant (107-108 M), na naglilimita sa sensitivity kapag sinusukat ang konsentrasyon ng protina.
Bilang karagdagan sa histochemical analysis, ang pag-aaral ng proteome ay isinasagawa gamit ang biological microarrays. Ang mga microarray ng protina ay isang epektibong tool sa translational na gamot, ngunit limitado sa kanilang paggamit para sa malakihang pananaliksik sa proteome. Ang paggamit ng mga teknolohiyang microarray sa proteomics ay bihirang nagbibigay-daan para sa pagkakakilanlan ng higit sa sampung protina sa isang pagkakataon: na may pagtaas sa bilang ng mga nasuri na protina, ang standardisasyon ng mga kondisyon para sa pakikipag-ugnayan ng antigen-antibody ay mahirap. Kaya, ang paggamit ng mga microarray ay humahantong sa paglitaw ng mga maling-negatibong resulta sa kaso kapag ang mga pagkakaiba sa mga constant ng dissociation para sa mga antigen-antibody complex ay ilang mga order ng magnitude. Bilang karagdagan, ang katatagan ng mga antibodies ay lubos na nakasalalay sa mga kondisyon ng kanilang imbakan; samakatuwid, ang paggamit ng mga microarray ng protina ay limitado sa oras kaagad pagkatapos ng kanilang paggawa, na hindi pinapayagan ang ganitong uri ng pagsusuri na malawakang magamit.
Ang pangalawang linya ng pananaliksik sa proteome ay nauugnay sa pag-set up ng isang eksperimento sa tinatawag na "panoramic" (survey) mode, kapag hindi alam nang maaga kung aling mga protina ang maaaring makilala. Posible, bilang isang resulta ng isang panoramic na eksperimento, ang anumang mga protina na naka-encode sa genome ng organismo sa ilalim ng pag-aaral ay maaaring makilala, kabilang ang mga produkto ng mga rehiyon ng genome na itinuturing na hindi coding. Ang mga teknikal at pamamaraang tool para sa buong genome na pag-aaral ng proteome ay ibinibigay ng biological mass spectrometry.
Mga katulad na tesis sa espesyalidad na "Mathematical biology, bioinformatics", 03.01.09 HAC code
Transcriptomic-proteomic na diskarte para sa pagsusuri ng mga proteoform ng HepG2 cell line 2018, Kandidato ng Biological Sciences Kiseleva, Olga Igorevna
Transcriptome at proteome ng chromosome 18: extrapolation ng mga resulta ng pagsusuri sa mga genome ng tao at mga object ng modelo 2017, Doktor ng Biological Sciences Ponomarenko, Elena Alexandrovna
Pagsusuri ng plasticity ng plasma proteome ng dugo ng isang malusog na tao sa ilalim ng matinding kondisyon ng mahahalagang aktibidad 2011, kandidato ng biological sciences Trifonova, Oksana Petrovna
Paghahanap at pagkilala sa mga potensyal na biomarker ng ovarian cancer sa serum ng tao 2015, kandidato ng biological sciences Arapidi, Georgy Pavlovich
Photodynamic Analysis ng Thylakoid Membrane Protein Complexes Gamit ang High-Resolution Mass Spectrometry 2011, kandidato ng agham ng kemikal na Galetsky, Dmitry Nikolaevich
Konklusyon ng disertasyon sa paksang "Mathematical biology, bioinformatics", Chernobrovkin, Alexey Leonidovich
1. Isinagawa ang proteomic mapping ng mass spectrometric data, kabilang ang pagkilala sa mga protina sa pamamagitan ng peptide mass imprint method, na sinusundan ng pagsusuri na naglalayong tukuyin ang mga proteotypic na peptide na partikular sa protina. Gamit ang halimbawa ng mga protina ng cytochrome P450 superfamily, ipinakita na sa pamamagitan ng pagma-map ng mga localization zone ng protina sa gel, ang antas ng pagkakasunud-sunod na saklaw ng natukoy na mga fragment ng peptide ay tumataas ng 27%.
2. Ang mga proteolytic peptides na tiyak para sa mga anyo ng cytochromes P450 CYP3A4 at CYP3A5 ay natukoy, ang pagkakakilanlan ng pagkakasunud-sunod ay 82%. Natukoy ang mga variant ng allelic translation ng cytochromes CYP3A4 at CYP3A5 na naglalaman ng single amino acid polymorphism na M445N (ZA4), K96E (ZA4), L82R (ZA5), at D277E (ZA5).
3. Ang isang umuulit na algorithm ay binuo para sa pagkilala ng mga single amino acid protein polymorphism sa pamamagitan ng tandem mass spectra ng proteolytic peptides. Kapag sinubukan sa Aurum Dataset control set, ang polymorphism detection algorithm ay nagpakita ng specificity na higit sa 95%. Ang sensitivity ng algorithm ay nasa antas na 30%, na tumutugma sa average na antas ng saklaw ng mga pagkakasunud-sunod na kasama sa control set.
4. Bilang resulta ng pagsusuri ng mga mass spectrometric na eksperimento na idineposito sa repositoryo ng PRIDE, kabuuang 270 solong amino acid polymorphism ang natukoy sa 156 na protina ng tao, kabilang ang 51 PDA (45 protina) na nauugnay sa mga sakit, kabilang ang mga karamdaman sa coagulation ng dugo. system at systemic amyloidosis.
Listahan ng mga sanggunian para sa pananaliksik sa disertasyon Kandidato ng Biological Sciences Chernobrovkin, Alexey Leonidovich, 2012
1. Archakov A.I. et al Paraan para sa pagpapabuti ng katumpakan ng pagtukoy sa pagkakasunud-sunod ng mga residue ng amino acid ng isang biopolymer batay sa data ng mass spectrometric analysis, computer system //2010.
2. Archakov A.I. P450 cytochromes, medicinal disease at personalized na gamot. Bahagi 1 // Klinikal na gamot. 2008. V. 86. Blg. 2. S. 4-8.
3. Klyuev H.A., Brodsky E.S. Mga modernong pamamaraan ng mass-spectrometric na pagsusuri ng mga organikong compound // Ros. chem. mabuti. (J. Russian Chemical Society na pinangalanang D.I. Mendeleev). 2002. Tomo XLVI. Bilang 4. S. 57-63.
4. Fox A.B. et al. One-dimensional na proteomic mapping ng mga cytochromes ng atay ng tao P450 // Biochemistry. 2009. V. 74. Blg. 2. S. 153-161.
5. Myasoedova K.N. Bago sa pag-aaral ng cytochromes P450 // Biochemistry. 2008. V. 73. No. 9. pp. 1199-1205.
6. Petushkova H.A. Pagkilala sa mga cytochromes P450 microsome ng mga selula ng atay ng tao gamit ang mass spectrometry // Biomedical chemistry. 2007. V. 53. Blg. 4. pp. 400-11.
7. Ponomarenko E.A., Ilgisonis E.V., Lisitsa A.V. Mga teknolohiya ng kaalaman sa proteomics // Bioorganic chemistry. 2011. V. 37. Blg. 2. S. 190-198.
8. Ponomarenko E.A. et al. Detection ng differentially expressed proteins gamit ang awtomatikong meta-analysis ng proteomic publication // Biomedical Chemistry. 2009. V. 3. Blg. 1. S. 10-16.
9. Savelyeva M. et al Kahalagahan ng genetic polymorphism ng cytochrome P450 isoenzymes para sa personalized na pagpili at dosing regimen ng antidepressants at antipsychotics // Clinical Medicine. 2008. V. 86. Blg. 11. S. 22-28.
10. Isang gene-centric human proteome project: HUPO~the Human Proteome na organisasyon. // Molecular at cellular proteomics: MCP. 2010. V. 9. Blg. 2. S. 4279.
11. Aebersold R., Mann M. Mass spectrometry-based proteomics. // Kalikasan. 2003. T. 422. Blg. 6928. C. 198-207.
12. Ahrne E., Mtiller M., Lisacek F. Hindi pinaghihigpitang pagkakakilanlan ng mga binagong protina gamit ang MS/MS // Proteomics. 2010. V. 10. Bilang 4. C. 671-686.
13. Akiyama M. h "p. Ichthyosis bullosa ng Siemens: ang tamang diagnosis nito na pinadali ng molecular genetic testing. // Ang British journal ng dermatology. 2005. T. 152. No. 6. C. 1353-6.
14. Alves G. h jxp. Pag-calibrate ng mga E-value para sa mga pamamaraan ng paghahanap sa database ng MS2. // Direktang biology. 2007. T. 2. Blg. 1. C. 26.
15. Alves G., Ogurtsov A.Y., Yu Y.-K. RAId DbS: mass-spectrometry based peptide identification web server na may integration ng kaalaman. // BMCgenomics. 2008. T. 9. C. 505.
16. Archakov A. hzip. Biospecific na hindi maibabalik na pangingisda kasama ng atomic force microscopy para sa pagtuklas ng napakababang-sagana na mga protina. // Proteomics. 2009. V. 9. Bilang 5. C. 1326-43.
17. Archakov A. h ap. Gene-centric na view sa proyekto ng human proteome: ang halimbawa ng roadmap ng Russia para sa chromosome 18. // Proteomics. 2011. T. 11. Bilang 10. C. 1853-6.
18. Archakov A.I. hzip. Ang AFM fishing nanotechnology ay ang paraan upang baligtarin ang numero ng Avogadro sa proteomics. // Proteomics. 2007. T. 7. Bilang 1. C. 4-9.
19. Archakov A.I., Bachmanova G.I. Cytochrome P-450 at aktibong oxygen. London: Taylor at Francis, 1990.
20. Asara J.M. h^p. Isang paraan ng quantification na walang label sa pamamagitan ng MS/MS TIC kumpara sa SILAC at spectral counting sa isang screen ng proteomics. // Proteomics. 2008. V. 8. Bilang 5. C. 994-9.
21. Bairoch A., Apweiler R. Ang database ng sequence ng protina ng SWISS-PROT at ang supplement nito na TreMBL noong 2000. // Pananaliksik sa mga nucleic acid. 2000. T. 28. Blg. 1. C. 45-8.
22 Baldwin M. a. Pagkilala sa protina sa pamamagitan ng mass spectrometry: mga isyu na dapat isaalang-alang. //Molecular at cellular proteomics: MCP. 2004. T. 3. Bilang 1. C. 1-9.
23. Bantscheff M. hap. Ang dami ng kemikal na proteomic ay nagpapakita ng mga mekanismo ng pagkilos ng mga klinikal na ABL kinase inhibitors. // Bioteknolohiya ng kalikasan. 2007a. T. 25. Bilang 9. C. 1035-44.
24. Bantscheff M. h, qp. Quantitative mass spectrometry sa proteomics: isang kritikal na pagsusuri. //Analytical at bioanalytical chemistry. 2007b. T. 389. Bilang 4. C. 1017-31.
25. Barsnes H. hap. PRIDE Converter: ginagawang madali ang pagbabahagi ng data ng proteomics. // Bioteknolohiya ng kalikasan. 2009. V. 27. Bilang 7. C. 598-9.
26. Baumgardner L.A. h Mabilis na parallel tandem mass spectral library na naghahanap gamit ang GPU hardware acceleration. // Journal ng proteome research. 2011. V. 10. Bilang 6. C. 2882-8.
27. Beck F. hap. Ang mabuti, ang masama, ang pangit: Pagpapatunay sa mass spectrometric analysis ng binagong peptides // PROTEOMICS. 2011. C. n/a-n/a.
28. Bell A.W. h/jp. Ang mikroskopyo ng protina: pagsasama ng mass spectrometry sa cell biology. //Mga pamamaraan ng kalikasan. 2007. T. 4. Bilang 10. C. 783-4.
29. Binz P.-A. h ,qp. Isang Molecular Scanner Upang I-automate ang Proteomic Research at Upang Magpakita ng Proteome Images // Analytical Chemistry. 1999. T. 71. Blg. 21. C. 49814988.
30. Binz P.-A. h pp. Ang molekular scanner: konsepto at pag-unlad. // Kasalukuyang opinyon sa biotechnology. 2004. T. 15. Bilang 1. C. 17-23.
31. Birney E. hap. Isang pangkalahatang-ideya ng Ensembl. // Pananaliksik sa genome. 2004. T. 14. Bilang 5. C. 925-8.
32. Birney E., Clamp M., Hubbard T. Mga database at tool para sa pag-browse ng mga genome. // Taunang pagsusuri ng genomics at genetics ng tao. 2002. T. 3. C. 293-310.
33. Bochet P. h flp. Maaaring matukoy ng LC-MS na walang fragmentation ang daan-daang protina // PROTEOMICS. 2010. V. 11. Blg. 1. C. n/a-n/a.
34. Boguski M.S., Lowe T.M., Tolstoshev C.M. dbEST-database para sa "mga ipinahayag na sequence tag". // Henetika ng kalikasan. 1993. T. 4. Bilang 4. C. 332-3.
35 Borges C.R. hnp. Full-length characterization ng mga protina sa populasyon ng tao. // Klinikal na kimika. 2010. V. 56. Blg. 2. C. 202-11.
36. Bromberg Y., Rost B. SNAP: hulaan ang epekto ng mga hindi magkasingkahulugan na polymorphism sa paggana. // Pananaliksik sa mga nucleic acid. 2007. V. 35. Blg. 11. C. 3823-35.
37. Brosch M. h np. Paghahambing ng pagganap ng Mascot at XITandem para sa mababa at mataas na katumpakan ng mass spectrometry at pagbuo ng isang na-adjust na threshold ng Mascot. // Molecular at cellular proteomics: MCP. 2008. V. 7. Bilang 5. C. 962-70.
38. Bunger M.K. h^p. Ang pagtuklas at pagpapatunay ng mga hindi magkasingkahulugan na coding SNP mula sa orthogonal analysis ng data ng shotgun proteomics. // Journal ng proteome research. 2007. T. 6. Bilang 6. C. 2331-40.
39 Bunkenborg J. h jip. Pag-screen para sa mga N-glycosylated na protina sa pamamagitan ng liquid chromatography mass spectrometry. // Proteomics. 2004. T. 4. Bilang 2. C. 454-65.
40. Butenas S., Mann K. G., Butenas B. Blood Coagulation. : MAIK Nauka/Interperiodica na eksklusibong ipinamahagi ng Springer Science+Business Media LLC., 2002.
41. Canas B. h jyp. Mga teknolohiya ng mass spectrometry para sa proteomics. // Mga briefing sa functional genomics at proteomics. 2006. T. 4. Bilang 4. C. 295-320.
42 Pangangalaga M.A. h Mapanirang hula sa SNP: ingatan ang iyong data ng pagsasanay! // Bioinformatics (Oxford, England). 2007. V. 23. Bilang 6. C. 664-72.
43. Casado-Vela J. h flp. Mga ilaw at anino ng mga teknolohiyang proteomic para sa pag-aaral ng mga species ng protina kabilang ang mga isoform, mga variant ng splicing at mga pagbabago sa post-translational na protina. // Proteomics. 2011. V. 11. Bilang 4. C. 590-603.
44. Chapman P.F. hap. Genes, modelo at Alzheimer's disease // Trends in Genetics. 2001. T. 17. No. 5. C. 254-261.
45. Chen M. hap. Anotasyon ng Hindi Magkasingkahulugan na Single Polymorphism sa Human Liver Proteome sa pamamagitan ng Mass Spectrometry // Protein at Peptide Letters. 2010. V. 17. Bilang 3. C. 277-286.
46. Chen R. hzip. Pagsusuri ng glycoproteomics ng tissue ng atay ng tao sa pamamagitan ng kumbinasyon ng maramihang enzyme digestion at hydrazide chemistry. // Journal ng proteome research. 2009. V. 8. Blg. 2. C. 651-61.
47 Choudhary J.S. h Pagtatanong sa genome ng tao gamit ang hindi na-interpret na data ng mass spectrometry. // Proteomics. 2001a. T. 1. Bilang 5. C. 651-67.
48 Choudhary J.S. h "p. Pagtutugma ng peptide mass spectra sa EST at genomic DNA database. // Mga uso sa biotechnology. 2001b. T. 19. No. 10 Suppl. C.S17-22.
49. Choudhury V. hap. Dalawang nobelang antithrombin na variant (L99V at Q118P) na nagbabago sa heparin binding // Nouvelle Revue Française. 1994. T. 36. C. 268.
50. Colinge J., Bennett K.L. Panimula sa computational proteomics. // PLoS computational biology. 2007. T. 3. No. 7. C. el 14.
51 Cooksey A.M. hap. Pagkilala sa mga biomarker ng dugo at mga proseso ng pisyolohikal na nagpapakilala sa mga tao na may mahusay na pagganap sa ilalim ng sikolohikal na stress. // PloS isa. 2009. V. 4. Blg. 12. C. e8371.
52. Cooper D. Ang database ng mutation ng gene ng tao // Nucleic Acids Research. 1998. T. 26. Hindi. l.C. 285-287.
53. Côte R.G. hup. Ang Ontology Lookup Service: mas maraming data at mas mahuhusay na tool para sa mga kinokontrol na query sa bokabularyo. // Pananaliksik sa mga nucleic acid. 2008. V. 36. Hindi. isyu sa Web Server. C. W372-6.
54. Cottrell J.S. Pagkilala sa protina sa pamamagitan ng peptide mass fingerprinting. // Pananaliksik sa peptide. 1994. V. 7. Blg. 3. C. 115-24.
55. Craig R., Beavis R.C. TANDEM: pagtutugma ng mga protina na may tandem mass spectra. // Bioinformatics (Oxford, England). 2004. T. 20. Bilang 9. C. 1466-7.
56. Craig R., Cortens J.P., Beavis R.C. Open source system para sa pagsusuri, pagpapatunay, at pag-iimbak ng data ng pagkakakilanlan ng protina. // Journal ng proteome research. 2004. T. 3. Bilang 6. C. 1234-42.
57. Creasy D.M., Cottrell J.S. Error tolerant na paghahanap ng hindi na-interpret na data ng tandem mass spectrometry // PROTEOMICS. 2002. T. 2. Bilang 10. C. 1426-1434.
58. Crockett D.K. hap. Annotated na proteome ng isang T-cell lymphoma ng tao. // Journal ng biomolecular techniques: JBT. 2005. T. 16. Bilang 4. C. 341-6.
59 Dai D. h jvp. Pagkilala sa Mga Variant ng CYP3A4 at Pagkilala sa Kanilang Mga Kakayahang I-metabolize ang Testosterone at Chlorpyrifos // J. Pharmacol. Exp. Doon. 2001. T. 299. Blg. 3. C. 825-831.
60. Delahunty C., Yates J.R. Pagkilala ng mga protina sa mga kumplikadong mixture gamit ang likidong chromatography at mass spectrometry. // Mga kasalukuyang protocol sa cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino. et al. 2003. T. Kabanata 5. C. Yunit 5.6.
61. Delahunty C.M., III J.R.Y. Tech Insight MudPIT: multidimensional protein identification technology Tech Insight // Biotechniques. 2007. T. 43. No. 5.
62. Desiere F. h jjp. Ang proyektong PeptideAtlas. // Pananaliksik sa mga nucleic acid. 2006. V. 34. No. Isyu sa database. C. D655-8.
63. Deutsch E. mzML: isang solong, pinag-isang format ng data para sa output ng mass spectrometer. // Proteomics. 2008. V. 8. Bilang 14. C. 2776-7.
64.Deutsch E.W. Ang PeptideAtlas Project. // Mga pamamaraan sa molecular biology (Clifton, N.J.). 2010. T. 604. C. 285-96.
65.Deutsch E.W. h^p. Isang guided tour ng Trans-Proteomic Pipeline. // Proteomics. 2010. T. 10. No. 6. C. 1150-9.
66Deutsch E.W. h^p. Human Plasma Peptide Atlas. // Proteomics. 2005. V. 5. Blg. 13. C. 3497-500.
67. Deutsch E.W., Lam H., Aebersold R. PeptideAtlas: isang mapagkukunan para sa pagpili ng target para sa mga umuusbong na naka-target na daloy ng trabaho sa proteomics. // Mga ulat ng EMBO. 2008. T. 9. Bilang 5. C. 429-34.
68. Eckel-Passow J.E. h jsp. Isang insight sa high-resolution na mass-spectrometry data. // Biostatistics (Oxford, England). 2009. V. 10. Bilang 3. C. 481-500.
69. Eng J.K., McCormack A.L., Yates III J.R. Isang diskarte upang maiugnay ang tandem mass spectral data ng mga peptides na may mga pagkakasunud-sunod ng amino acid sa isang database ng protina // Journal ng American Society para sa Mass Spectrometry. 1994. V. 5. Blg. 11. C. 976-989.
70. Eriksson J., Fenyo D. Probity: Isang Protein Identification Algorithm na may Tumpak na Pagtatalaga ng Statistical Significance ng Mga Resulta // Journal of Proteome Research. 2004. T. 3. Bilang 1. C. 32-36.
71. Falkner J. a h up. Na-validate ang MALDI-TOF/TOF mass spectra para sa mga pamantayan ng protina. // Journal ng American Society para sa Mass Spectrometry. 2007. T. 18. Bilang 5. C. 850-5.
72. Farrah T. h Isang high-confidence na human plasma proteome reference set na may mga tinantyang konsentrasyon sa PeptideAtlas. // Molecular at cellular proteomics: MCP. 2011.
73. Field D., Wilson G., Gast C. van der. Paano natin inihahambing ang daan-daang bacterial genome? // Kasalukuyang opinyon sa microbiology. 2006. T. 9. Bilang 5. C. 499-504.
74. Frazer K. a hap. Isang pangalawang henerasyong human haplotype na mapa ng mahigit 3.1 milyong SNP. // Kalikasan. 2007. T. 449. Blg. 7164. C. 851-61.
75. Fredman D. hap. HGVbase: isang na-curate na mapagkukunan na naglalarawan ng pagkakaiba-iba ng DNA ng tao at mga relasyon sa phenotype. // Pananaliksik sa mga nucleic acid. 2004. V. 32. No. Isyu sa database. C.D516-9.
76. Pinalayang G.L. h^p. Differential capture ng serum proteins para sa expression profiling at pagtuklas ng biomarker sa mga sample ng cancer sa ulo at leeg bago at pagkatapos ng paggamot. // Ang Laryngoscope. 2008. T. 118. Blg. 1. C. 61-8.
77. Gabellini N. NTRK2 (Neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2) // Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. 2008. T. 12. Bilang 4. C. 314-317.
78. Galeva N. Direktang Pagkilala sa Cytochrome P450 Isozymes sa pamamagitan ng Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time ng Flight-Based Proteomic Approach // Drug Metabolism and Disposition. 2003. T. 31. Bilang 4. C. 351-355.
79. Galeva N., Altermann M. Paghahambing ng one-dimensional at two-dimensional na gel electrophoresis bilang isang tool sa paghihiwalay para sa proteomic analysis ng rat liver microsomes: cytochromes P450 at iba pang mga protina ng lamad. // Proteomics. 2002. T. 2. Bilang 6. C. 713-22.
80. Gao M. hj\p. Malaking scale depletion ng mga high-abundance na protina at pagsusuri ng middle- at low-abundance na mga protina sa human liver proteome sa pamamagitan ng multidimensional liquid chromatography. // Proteomics. 2008. V. 8. Blg. 5. C. 93947.
81. Garcia-Blanco M.a, Baraniak A.P., Lasda E.L. Alternatibong splicing sa sakit at therapy. // Bioteknolohiya ng kalikasan. 2004. T. 22. Bilang 5. C. 535-46.
82. Gatlin C.L. hap. Automated Identification ng Amino Acid Sequence Variations in Proteins by HPLC/Microspray Tandem Mass Spectrometry // Analytical Chemistry. 2000. T. 72. Blg 4. C. 757-763.
83. Gobom J. h £p. Isang Paraan ng Pag-calibrate na Pinapasimple at Pinapabuti ang Tumpak na Pagtukoy ng Peptide Molecular Mass ng MALDI-TOF MS // Analytical Chemistry. 2002. V. 74. Blg. 15. C. 3915-3923.
84. Griss J. hap. Nai-publish at Napahamak? ang impluwensya ng hinanap na database ng protina sa pangmatagalang imbakan ng data ng proteomics. // Molecular at cellular proteomics: MCP. 2011. V. 10. Blg. 9. C. Ml 11.008490.
85. Grone J. h^p. Ang pagkakaiba-iba ng pagpapahayag ng mga gene na nag-encode ng masikip na mga protina ng junction sa colorectal cancer: madalas na dysregulation ng claudin-1, -8 at -12. // International journal ng colorectal disease. 2007. V. 22. Bilang 6. C. 651-9.
86. Hamosh A. h £p. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), isang knowledgebase ng mga gene ng tao at genetic disorder. // Pananaliksik sa mga nucleic acid. 2005. V. 33. No. Isyu sa database. C. D514-7.
87. Hamosh A. hap. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). // mutation ng tao. 2000. T. 15. Blg. 1. C. 57-61.
88. Han X., Aslanian A., Yates III J.R. Mass spectrometry para sa proteomics // Kasalukuyang Opinyon sa Chemical Biology. 2008. T. 12. Bilang 5. C. 483-490.
89. Hedden P. hap. Gibberellin Biosynthesis sa Mga Halaman at Fungi: Isang Kaso ng Convergent Evolution? // Journal ng regulasyon sa paglago ng halaman. 2001. T. 20. Bilang 4. C. 319-331.
90. Hopfgartner G. h Triple quadrupole linear ion trap mass spectrometer para sa pagsusuri ng maliliit na molekula at macromolecules. // Journal ng mass spectrometry: JMS. 2004. V. 39. Bilang 8. C. 845-55.
91. Huang Y. n flp. Statistical characterization ng charge state at residue dependence ng low-energy CID peptide dissociation patterns. // Analytical chemistry. 2005. V. 77. Blg. 18. C. 5800-13.
92. Hubbard T. Ang Ensembl genome database project // Nucleic Acids Research. 2002. T. 30. Blg. 1. C. 38-41.
93. Hustert E. h £p. Ang genetic determinants ng CYP3A5 polymorphism. // Pharmacogenetics. 2001. T. 11. Blg. 9. p. 773-9.
94. Ilina E.N. h^p. Direktang bacterial profiling sa pamamagitan ng matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry para sa pagkilala sa pathogenic na Neisseria. // Ang Journal ng molecular diagnostics: JMD. 2009. T. 11. Blg. 1. C. 7586.
95. Ingelman-Sundberg M. Human drug metabolizing cytochrome P450 enzymes: mga katangian at polymorphism. // Naunyn-Schmiedeberg "s archives of pharmacology. 2004. T. 369. No. 1. C. 89-104.
96. International Human Genome Sequencing Consortium. Tinatapos ang euchromatic sequence ng genome ng tao. // Kalikasan. 2004. T. 431. Blg. 7011. C. 931-45.
97. Ishihama Y. h pp. Exponentially modified protein abundance index (emPAI) para sa pagtatantya ng ganap na halaga ng protina sa proteomics sa pamamagitan ng bilang ng mga sequenced peptides bawat protina. // Molecular at cellular proteomics: MCP. 2005. T. 4. Bilang 9. C. 1265-72.
98. Jain R., Wagner M. Kolmogorov-Smirnov score at intrinsic fingerprint mass tolerances para sa peptide massing. // Journal ng proteome research. 2010. V. 9. Blg. 2. C. 737-42.
99. Jeffrey L. Cummings. Mga ugnayang genotype-proteotype-phenotype sa mga sakit na neurodegenerative. : Springer, 2005.
100. Jenkins R.E. hap. Relative at absolute quantitative expression profiling ng cytochromes P450 gamit ang isotope-coded affinity tags. // Proteomics. 2006. T. 6. Bilang 6. C. 1934-47.
101. Jones P. h flp. PRIDE: isang pampublikong imbakan ng mga pagkakakilanlan ng protina at peptide para sa komunidad ng proteomics. // Pananaliksik sa mga nucleic acid. 2006. V. 34. No. Isyu sa database. C. D659-63.
102. Jones P. h flp. PRIDE: mga bagong development at bagong dataset. // Pananaliksik sa mga nucleic acid. 2008. V. 36. No. Isyu sa database. C. D878-83.
103. Kalmar L. h jip. Mutation screening ng CI inhibitor gene sa mga Hungarian na pasyente na may namamana na angioedema. // mutation ng tao. 2003. T. 22. Blg. 6. C. 498.
104. Keller A. hap. Empirical Statistical Model Upang Tantyahin ang Katumpakan ng Mga Pagkilala sa Peptide na Ginawa ng MS/MS at Paghahanap sa Database // Analytical Chemistry. 2002. V. 74. Blg. 20. C. 5383-5392.
105. Kersey P.J. njjp. Ang International Protein Index: isang pinagsamang database para sa mga eksperimento sa proteomics. // Proteomics. 2004. T. 4. Bilang 7. C. 1985-8.
106. Kim S., Gupta N., Pevzner P. a. Mga spectral na probabilidad at pagbuo ng mga function ng tandem mass spectra: isang strike laban sa mga database ng decoy. // Journal ng proteome research. 2008. T. 7. Bilang 8. C. 3354-63.
107. Klie S. h £p. Pagsusuri ng mga malalaking proyekto ng proteomics na may nakatagong semantic indexing. // Journal ng proteome research. 2008. V. 7. Bilang 1. C. 182-91.
108. Kremer H. hup. Ang Ichthyosis Bullosa ng Siemens ay Dulot ng Mga Mutation sa Keratin 2e Gene. // Journal of Investigative Dermatology. 1994. T. 103. Blg. 3. C. 286-289.
109. Kuehl P. hap. Ang pagkakaiba-iba ng pagkakasunud-sunod sa mga tagataguyod ng CYP3A at paglalarawan ng genetic na batayan ng polymorphic CYP3A5 expression. // Henetika ng kalikasan. 2001. T. 27. Blg. 4. C. 383-91.
110. Kuhn R.M. hup. Ang UCSC Genome Browser Database: update 2009. // Nucleic research acids. 2009. V. 37. No. Isyu sa database. C. D755-61.
111. Kuster B. h flp. Ang mass spectrometry ay nagbibigay-daan sa direktang pagkakakilanlan ng mga protina sa malalaking genome. //Proteomics. 2001. T. 1. Blg. 5. p. 641-50.
112. Lane C.S. hap. Comparative cytochrome P450 proteomics sa mga atay ng immunodeficient mice gamit ang 180 stable isotope labeling. // Molecular at cellular proteomics: MCP. 2007. T. 6. Bilang 6. C. 953-62.
113. Lane C.S. h ,qp. Ang pagkakakilanlan ng mga cytochrome P450 na enzyme sa mga colorectal metastases ng tao at ang nakapalibot na atay: isang proteomic na diskarte. // European journal ng cancer (Oxford, England: 1990). 2004. V. 40. Blg 14. C. 2127-34.
114 Lane E.B., McLean W.H.I. Keratin at mga karamdaman sa balat. // Ang Journal ng Patolohiya. 2004. T. 204. Blg. 4. C. 355-66.
115. Levine a J. P53, ang Cellular Gatekeeper para sa Paglago at Dibisyon. // selda. 1997. V. 88. Blg. 3. C. 323-31.
116. Levy S. h AP- Ang diploid genome sequence ng isang indibidwal na tao. // biology ng PLoS. 2007. V. 5. Bilang 10. C. e254.
117. Lewis D.F.V. 57 varieties: ang human cytochromes P450. // Pharmacogenomics. 2004. V. 5. Bilang 3. C. 305-18.
118. Lim A. hap. Characterization ng Transthyretin Variants sa Familial Transthyretin Amyloidosis sa pamamagitan ng Mass Spectrometric Peptide Mapping at DNA Sequence Analysis // Analytical Chemistry. 2002. V. 74. Blg. 4. C. 741-751.
119. Lim H. Pagkilala sa mga 2D-gel na protina: Isang paghahambing ng MALDI/TOF peptide mass mapping sa p LC-ESI tandem mass spectrometry // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2003. T. 14. Bilang 9. C. 957-970.
120. Lisitsa A.V. h "p. Application ng slicing ng one-dimensional gels na may kasunod na slice-by-slice mass spectrometry para sa proteomic profiling ng human liver cytochromes P450. // Journal ng proteome research. 2010. V. 9. Blg. 1. C. 95-103.
121. Liu T. hap. High dynamic range characterization ng trauma patient plasma proteome. // Molecular at cellular proteomics: MCP. 2006. V. 5. Blg. 10. C. 1899913.
122. Liu T. h /ip. Human Plasma N-Glycoproteome Analysis sa pamamagitan ng Immunoaffinity Subtraction, Hydrazide Chemistry, at Mass Spectrometry // Journal ng proteome research. 2005. T. 4. Bilang 6. C. 2070-2080.
123. Mallick P. h flp. Computational prediction ng proteotypic peptides para sa quantitative proteomics. // Bioteknolohiya ng kalikasan. 2007. V. 25. Blg. 1. C. 125-31.
124. Mann M., Jensen O.N. Proteomic na pagsusuri ng mga post-translational na pagbabago. // Bioteknolohiya ng kalikasan. 2003. T. 21. Bilang 3. C. 255-61.
125. Mann M., Wilm M. Error-Tolerant Identification ng Peptides sa Sequence Database sa pamamagitan ng Peptide Sequence Tag // Analytical Chemistry. 1994. V. 66. Blg. 24. C. 4390-4399.
126. Marchetti A.h pp. Mga madalas na mutasyon sa neurotrophic tyrosine receptor kinase gene family sa malaking cell neuroendocrine carcinoma ng baga. // mutation ng tao. 2008. V. 29. Blg. 5. C. 609-16.
127. Marichal P. h Kontribusyon ng mutasyon sa cytochrome P450 14(alpha)-demethylase (Ergllp, Cyp51p) sa azole resistance sa Candida albicans // Microbiology. 1999. T. 145. Blg. 10. C. 2701-2713.
128. Martens L. h jxp. PRIDE: ang database ng proteomics identifications. // Proteomics. 2005. T. 5. Blg. 13. C. 3537-45.
129. Matthiesen R., Amorim A. Proteomics na nahaharap sa kombinatoryal na problema. // Mga pamamaraan sa molecular biology (Clifton, N.J.). 2010. T. 593. C. 175-86.
130. McDonald W.H., Yates J.R. Shotgun proteomics: pagsasama ng mga teknolohiya para sagutin ang mga biological na tanong. // Kasalukuyang opinyon sa molecular therapeutics. 2003. V. 5. Bilang 3. C. 302-9.
131. Menon R., Omenn G.S. Proteomic characterization ng novel alternative splice variant proteins sa human epidermal growth factor receptor 2/neu-induced breast cancers. // Pananaliksik sa kanser. 2010. V. 70. Bilang 9. C. 3440-9.
132. Menschaert G. h £p. Peptidomics pagdating sa edad: isang pagsusuri ng mga kontribusyon mula sa isang anggulo ng bioinformatics. // Journal ng proteome research. 2010. T. 9. Blg. 5. C. 205161.
133. Millar D.S. h Tatlong nobelang missense mutations sa antithrombin III (AT3) na gene na nagdudulot ng paulit-ulit na venous thrombosis. // Henetika ng tao. 1994. T. 94. Blg. 5. C. 509-12.
134. Mironov A.A. Madalas na Alternatibong Pagdugtong ng mga Gene ng Tao // Pananaliksik sa Genome. 1999. T. 9. Blg. 12. C. 1288-1293.
135. Modrek B. Genome-wide detection ng alternatibong splicing sa ipinahayag na pagkakasunud-sunod ng mga gene ng tao // Nucleic Acids Research. 2001. T. 29. Blg. 13. C. 2850-2859.
136. Mueller M. h ap. Pagsusuri ng eksperimentong pagtuklas ng mga gene na nauugnay sa central nervous system sa utak ng tao at mga dataset ng cerebrospinal fluid. // Proteomics. 2008. V. 8. Bilang 6. C. 1138-48.
137. Nagaraj S.H., Gasser R.B., Ranganathan S. Gabay ng hitchhiker sa expressed sequence tag (EST) analysis. // Briefings sa bioinformatics. 2007. T. 8. No. 1. C. 621.
138. Nedelkov D. Populasyon proteomics: Pagsisiyasat ng pagkakaiba-iba ng protina sa mga populasyon ng tao // Proteomics. 2008. V. 8. Bilang 4. C. 779-86.
139. Nedelkov D. h ap. High-throughput na komprehensibong pagsusuri ng mga protina ng plasma ng tao: isang hakbang patungo sa proteomic ng populasyon. // Analytical chemistry. 2004. V. 76. Bilang 6. C. 1733-7.
140. Nedelkov D. h ^p. Pagsisiyasat ng pagkakaiba-iba sa mga protina ng plasma ng tao. // Mga Pamamaraan ng National Academy of Sciences ng United States of America. 2005. T. 102. Blg. 31. C. 10852-7.
141. Nesvizhskii A.I. Pagkilala sa protina sa pamamagitan ng tandem mass spectrometry at sequence database searching. // Mga pamamaraan sa molecular biology (Clifton, N.J.). 2007. T. 367. C. 87-119.
142. Nesvizhskii A.I., Vitek O., Aebersold R. Pagsusuri at pagpapatunay ng proteomic data na nabuo ng tandem mass spectrometry // Mga Paraan ng Kalikasan. 2007. T. 4. Bilang 10. C. 787-797.
143. Ng P.C. h flp. Genetic Variation sa isang indibidwal na exome ng tao // PLoS Genetics. 2008. T. 4. No. 8.
144. Ong S.-E., Mann M. Mass spectrometry-based proteomics turns quantitative. // Biology ng kemikal ng kalikasan. 2005. T. 1. Blg. 5. p. 252-62.
145. Ossipova E., Fenyô D., Eriksson J. Pag-optimize ng mga kondisyon sa paghahanap para sa mass-based na pagkakakilanlan ng mga protina. // Proteomics. 2006. T. 6. Bilang 7. C. 2079-85.
146. Overbeek R. h, np. Anotasyon ng bacterial at archaeal genome: pagpapabuti ng katumpakan at pagkakapare-pareho. // Mga pagsusuri sa kemikal. 2007. V. 107. Blg 8. C. 3431-47.
147. Pedrioli P.G.A. Trans-proteomic pipeline: isang pipeline para sa proteomic analysis. // Mga pamamaraan sa molecular biology (Clifton, N.J.). 2010. T. 604. C. 213-38.
148. Perkins D.N. h^p. Pagkilala sa protina na nakabatay sa probabilidad sa pamamagitan ng paghahanap sa mga database ng sequence gamit ang data ng mass spectrometry // Electrophoresis. 1999. T. 20. Blg 18. C. 3551-3567.
149. Perry D.J., Carrell R.W. Molecular genetics ng kakulangan sa antithrombin ng tao. // mutation ng tao. 1996. T. 7. Bilang 1. C. 7-22.
150. Petrak J. ap. Deja vu sa proteomics. Isang hit parade ng paulit-ulit na natukoy na differentially expressed proteins. // Proteomics. 2008. V. 8. Bilang 9. C. 1744-9.
151. Pevzner P.A. h/ip. Ang kahusayan ng paghahanap sa database para sa pagkakakilanlan ng mga mutated at binagong protina sa pamamagitan ng mass spectrometry. // Pananaliksik sa genome. 2001. T. 11. Blg. 2. C. 290-9.
152. Porter C.J., Talbot C.C., Cuticchia A.J. Central mutation database-isang pagsusuri. // mutation ng tao. 2000. T. 15. Blg. 1. C. 36-44.
153. Rabilloud T., Hochstrasser D., Simpson R.J. Ang isang gene-centric human proteome project ba ang pinakamahusay na paraan para sa proteomics na maghatid ng biology? // Proteomics. 2010. C. 1-6.
154. Rappsilber J. h £p. Malaking proteomic analysis ng spliceosome ng tao. // Pananaliksik sa genome. 2002. T. 12. Bilang 8. C. 1231-45.
155. Redlich G. h zip. Pagkakaiba sa pagitan ng mga isoform ng cytochrome P450 (CYP) ng tao at pagkakakilanlan ng mga bagong site ng phosphorylation sa pamamagitan ng mass spectrometry. // Journal ng proteome research. 2008. V. 7. Bilang 11. C. 4678-88.
156. Reid G.E., McLuckey S.A. "Top down" na characterization ng protina sa pamamagitan ng tandem mass spectromety. // Journal ng mass spectrometry: JMS. 2002. V. 37. Blg. 7. C. 663-75.
157. Rodriguez C. hzip. Proteotyping ng human haptoglobin sa pamamagitan ng MALDI-TOF profiling: Phenotype distribution sa isang populasyon ng mga pasyente ng toxic oil syndrome. // Proteomics. 2006. T. 6. C. S272--81.
158. Roher A. h zip. Ang mga pagbabago sa istruktura sa peptide backbone ng beta-amyloid core protein ay maaaring dahilan para sa pagtitiwalag at katatagan nito sa Alzheimer's disease // J. Biol. Chem. 1993. T. 268. No. 5. c. 3072-3083.
159. Rostami-Hodjegan A., Tucker G.T. Simulation at hula ng in vivo na metabolismo ng gamot sa mga populasyon ng tao mula sa in vitro data. // Mga pagsusuri sa kalikasan. pagtuklas ng droga. 2007. T. 6. Bilang 2. C. 140-8.
160 Roth M.J. hzip. "Proteotyping": proteomics ng populasyon ng mga leukocyte ng tao gamit ang top down mass spectrometry. // Analytical chemistry. 2008. V. 80. Blg. 8. C. 285766.
161. Rozman D., Waterman M.R. Lanosterol 14alpha -Demethylase (CYP51) at Spermatogenesis // Drug Metab. Dispos. 1998. V. 26. Blg. 12. C. 1199-1201.
162. Rubina A.Y. hzip. Bakit 3-D? Mga microarray na nakabatay sa gel sa proteomics. // Proteomics. 2008. T. 8. No. 4. C. 817-31.
163. Sadygov R.G., Cociorva D., III J.R.Y. Malaking-scale database searching gamit ang tandem mass spectra: Hinahanap ang sagot sa likod ng libro // Nature Methods. 2004. T. 1. Bilang 3. C. 195-202.
164. Sarkozy A. hzip. Germline BRAF mutations sa Noonan, LEOPARD, at cardiofaciocutaneous syndromes: molecular diversity at nauugnay na phenotypic spectrum. // mutation ng tao. 2009. V. 30. Bilang 4. C. 695-702.
165. Sattelle D.B., Jones A.K., Buckingham S.D. Mga genome ng insekto: mga hamon at pagkakataon para sa neuroscience. // Invertebrate neuroscience: IN. 2007. V. 7. Bilang 3. C. 133-6.
166. Schandorff S.h, np. Isang mass spectrometry-friendly na database para sa pagkilala sa cSNP. //Mga pamamaraan ng kalikasan. 2007. T. 4. Bilang 6. C. 465-6.
167. Schmuth M. h Ichthyosis update: patungo sa isang function-driven na modelo ng pathogenesis ng mga karamdaman ng cornification at ang papel ng mga corneocyte protein sa mga karamdamang ito. // Mga pagsulong sa dermatolohiya. 2007. T. 23. C. 231-56.
168. Schweigert F.J., Wirth K., Raila J. Characterization ng microheterogeneity ng transthyretin sa plasma at ihi gamit ang SELDI-TOF-MS immunoassay. // Proteome science. 2004. T. 2. Blg. 1. C. 5.
169. Searle B.C., Turner M., Nesvizhskii A.I. Pagpapabuti ng sensitivity sa pamamagitan ng probabilistically na pagsasama-sama ng mga resulta mula sa maramihang mga pamamaraan ng paghahanap ng MS/MS. // Journal ng proteome research. 2008. V. 7. Blg. 1. C. 245-53.
170. Seo J., Lee K.-J. Mga pagbabago sa post-translational at ang kanilang mga biological function: proteomic analysis at systematic approach. // Journal ng biochemistry at molecular biology. 2004. V. 37. Blg. 1. C. 35-44.
171. Sherry S.T. dbSNP: ang NCBI database ng genetic variation // Nucleic Acids Research. 2001. T. 29. Blg. 1. C. 308-311.
172. Shevchenko A. h j\p. Mass Spectrometric Sequencing ng Mga Protein mula sa Silver-Stained Polyacrylamide Gels // Analytical Chemistry. 1996. T. 68. Blg. 5. C. 850858.
173. Shi W.-feng h up. Proteotyping: Isang bagong diskarte sa pag-aaral ng ebolusyon ng influenza virus sa antas ng protina // Virologica Sinica. 2008. V. 22. Bilang 5. C. 405-411.
174. Shteynberg D. h np. iProphet: Ang multi-level na integrative analysis ng shotgun proteomic data ay nagpapabuti sa peptide at mga rate ng pagkakakilanlan ng protina at mga pagtatantya ng error. // Molecular at cellular proteomics: MCP. 2011. C. Ml 11.007690-.
175. Smigielski E.M. dbSNP: isang database ng solong nucleotide polymorphism // Nucleic Acids Research. 2000. T. 28. Blg. 1. C. 352-355.
176. Srebrow A., Kornblihtt A.R. Ang koneksyon sa pagitan ng splicing at cancer. // Journal ng cell science. 2006. V. 119. Hindi Pt 13. C. 2635-41.
177. Stamm S. hzip. ASD: isang mapagkukunan ng bioinformatics sa alternatibong splicing. // Pananaliksik sa mga nucleic acid. 2006. V. 34. No. Isyu sa database. C. D46-55.
178 Stein P.E., Carrell R.W. Ano ang sinasabi sa atin ng mga dysfunctional serpin tungkol sa molecular mobility at sakit? // Nature Structural Biology. 1995. T. 2. Bilang 2. C. 96-113.
179. Supek F. n zip. Pinahusay na analytical power ng SDS-PAGE gamit ang mga machine learning algorithm. //Proteomics. 2008. V. 8. Bilang 1. C. 28-31.
180. Taylor C.F. Mga minimum na kinakailangan sa pag-uulat para sa proteomics: isang MIAPE primer. // Proteomics. 2006. T. 6 Suppl 2. C. 39-44.
181. Taylor C.F. hzip. Ang pinakamababang impormasyon tungkol sa isang eksperimento sa proteomics (MIAPE). // Bioteknolohiya ng kalikasan. 2007. V. 25. Bilang 8. C. 887-93.
182. Thiede B. h zip. Peptide mass fingerprinting. // Mga Paraan (San Diego, Calif.). 2005. T. 35. Blg. 3. C. 237-47.
183. Tsvetkov P.O. hzip. Ang isomerization ng Asp7 residue ay nagreresulta sa zinc-induced oligomerization ng Alzheimer's disease amyloid beta(l-16) peptide. // Chembiochem: isang European journal ng chemical biology. 2008. T. 9. No. 10. C. 1564-7.
184. Uhlen M. h zip. Isang human protein atlas para sa normal at cancer tissues batay sa antibody proteomics. // Molecular at cellular proteomics: MCP. 2005. T. 4. Bilang 12. C. 1920-32.
185. Ullrich A. hzip. PROTEIN KINASE NA KAUGNAY NG CANCER // US Patent App. 12/. 2007.
186. Venter J.C. hzip. Ang pagkakasunud-sunod ng genome ng tao. // Agham (New York, N.Y.). 2001. T. 291. Blg. 5507. C. 1304-51.
187. Vizcaino J.A., Foster J.M., Martens L. Proteomics data repository: Nagbibigay ng ligtas na kanlungan para sa iyong data at kumikilos bilang springboard para sa karagdagang pananaliksik // Journal of Proteomics. 2010. C. 1-11.
188. W Vogel K. h zip. Pagbuo ng mga pagsusuri para sa pagtuklas ng kinase na gamot saan nanggaling ang mga pag-unlad? // 2007.
189. Westlind-Johnsson A. Ang paghahambing na pagsusuri ng CYP3A expression sa atay ng tao ay nagmumungkahi lamang ng isang maliit na papel para sa CYP3A5 sa metabolismo ng droga // Metabolismo at Disposisyon ng Gamot. 2003. T. 31. Hindi. >6. C. 755-761.
190. Wheeler D.L. hzip. Mga mapagkukunan ng database ng National Center for Biotechnology Information. // Pananaliksik sa mga nucleic acid. 2007. V. 35. No. Isyu sa database. C.D5-12.
191. Whibley C., Pharoah P.D.P., Hollstein M. p53 polymorphism: mga implikasyon ng cancer. //Mga pagsusuri sa kalikasan. kanser. 2009. V. 9. Blg. 2. C. 95-107.
192. Wilkins M.R. h/ip. Mula sa Protein hanggang Proteome: Malaking Scale Protein Identification sa pamamagitan ng Two-Dimensional Electrophoresis at Amino Acid Analysis // Bio/Technology. 1996. T. 14. Blg. 1. C. 61-65.
193. Wu C.H. hap. Ang Universal Protein Resource (UniProt): isang lumalawak na uniberso ng impormasyon ng protina. // Pananaliksik sa mga nucleic acid. 2006. V. 34. No. Isyu sa database. C. D187-91.
194. Yates J R., Eng J.K., McCormack A.L. Mga Genome ng Pagmimina: Pag-uugnay ng Tandem Mass Spectra ng Binago at Hindi Binagong mga Peptides sa Mga Pagkakasunud-sunod sa Mga Database ng Nucleotide // Analytical Chemistry. 1995. V. 67. Blg. 18. C. 3202-3210.
195. Yip Y.L. h Pag-annotate ng mga single amino acid polymorphism sa UniProt/Swiss-Prot knowledgebase. // mutation ng tao. 2008. V. 29. Blg. 3. C. 3616.
196. Zanger U.M. hap. Polymorphic CYP2B6: mga mekanismo ng molekular at umuusbong na klinikal na kahalagahan. //Pharmacogenomics. 2007. T. 8. Bilang 7. C. 743-59.
197. Zgoda V.G. h£p. Proteomics ng mouse liver microsomes: pagganap ng iba't ibang mga workflow ng paghihiwalay ng protina para sa LC-MS/MS. // Proteomics. 2009. V. 9. Bilang 16. C. 4102-5.
198. Zhou H. hap. Quantitative proteome analysis sa pamamagitan ng solid-phase isotope tagging at mass spectrometry. // Bioteknolohiya ng kalikasan. 2002. T. 20. Bilang 5. C. 512-5.
199. Zubarev R.A., Zubarev A.R., Savitski M.M. Electron capture/transfer versus collisionally activated/induced dissociations: solo o duet? // Journal ng American Society para sa Mass Spectrometry. 2008. T. 19. Bilang 6. C. 753-61.
Pakitandaan na ang mga siyentipikong teksto na ipinakita sa itaas ay nai-post para sa pagsusuri at nakuha sa pamamagitan ng orihinal na dissertation text recognition (OCR). Kaugnay nito, maaaring maglaman ang mga ito ng mga error na nauugnay sa di-kasakdalan ng mga algorithm ng pagkilala. Walang ganoong mga error sa mga PDF file ng mga disertasyon at abstract na inihahatid namin.
Ang pinaka-katangian na katangian ng physicochemical ng mga protina ay: mataas na lagkit ng mga solusyon, bahagyang pagsasabog, ang kakayahang bumukol sa isang malawak na hanay, optical na aktibidad, kadaliang kumilos sa isang electric field, mababang osmotic pressure at mataas na oncotic pressure, ang kakayahang sumipsip ng UV rays sa 280 nm (ito ang huling pag-aari, dahil sa pagkakaroon ng mga mabangong amino acid sa mga protina, ay ginagamit upang mabilang ang mga protina).
Ang mga protina, tulad ng mga amino acid, ay amphoteric dahil sa pagkakaroon ng mga libreng NH2 at COOH na grupo at nailalarawan, ayon sa pagkakabanggit, ng lahat ng mga katangian ng mga acid at base.
Ang mga protina ay may binibigkas na mga katangian ng hydrophilic. Ang kanilang mga solusyon ay may napakababang osmotic pressure, mataas na lagkit at maliit na diffusivity. Ang mga protina ay may kakayahang bukol sa napakalaking lawak.
Ang isang bilang ng mga katangian ng katangian ay nauugnay sa koloidal na estado ng mga protina, sa partikular, ang phenomenon ng light scattering, na sumasailalim sa quantitative determination ng mga protina sa pamamagitan ng nephelometry. Ang epektong ito ay ginagamit din sa mga modernong pamamaraan ng mikroskopya ng mga biological na bagay. Ang mga molekula ng protina ay hindi makakadaan sa mga semi-permeable na artipisyal na lamad (cellophane, parchment, collodion), pati na rin ang mga biomembrane ng mga tisyu ng halaman at hayop, kahit na may mga organikong sugat, tulad ng mga bato, ang kapsula ng renal glomerulus (Shumlyansky-Bowman). ) nagiging permeable sa blood serum albumin, at lumilitaw ang mga ito sa ihi.
Denaturation ng protina Sa ilalim ng impluwensya ng iba't ibang pisikal at kemikal na mga kadahilanan, ang mga protina ay sumasailalim sa coagulation at precipitate, nawawala ang kanilang mga katutubong katangian. Kaya, ang denaturation ay dapat na maunawaan bilang isang paglabag sa pangkalahatang plano - ang natatanging istraktura ng isang katutubong molekula ng protina, na humahantong sa pagkawala ng mga katangian nitong katangian (solubility, electrophoretic mobility, biological activity, atbp.). Karamihan sa mga protina ay nagde-denature kapag pinainit ng isang solusyon sa itaas 50-60 ° C. Ang mga panlabas na pagpapakita ng denaturation ay nabawasan sa pagkawala ng solubility, lalo na sa isoelectric point, isang pagtaas sa lagkit ng mga solusyon sa protina, isang pagtaas sa dami ng libreng functional. SH-rpypp at isang pagbabago sa katangian ng X-ray scattering. Ang pinaka-katangian na tanda ng denaturation ay isang matalim na pagbaba o kumpletong pagkawala ng protina ng biological na aktibidad nito (catalytic antigenic o hormonal) na mga molekula ng protina at ang mga random at hindi maayos na istruktura ay nabuo.
