Pagsusuri ng DNA ng kometa ng spermatozoa. Paraan para sa pagproseso at pagsusuri ng mga larawan ng mga bagay na tulad ng kometa na nakuha ng pamamaraang "DNA-comet".

26.02.2022 | pautang ng sasakyan

Ang single cell gel electrophoresis method o DNA comet method ay lubhang sensitibo at nagbibigay ng mataas na pagiging maaasahan ng mga resultang nakuha, sa parehong oras ito ay medyo simple at mabilis na gumanap, at ito rin ay na-standardize sa buong mundo (OECD No. 489). Ang pamamaraang ito ay ang pinaka-promising para sa paglutas ng mga sumusunod na problema:

Biomonitoring ng tao at kapaligiran, iyon ay, ang pagkilala sa mga kahihinatnan ng sapilitan na mutagenesis kapag ang isang tao ay nakipag-ugnayan sa xenobiotics (mga gamot, mga additives sa pagkain, mga pestisidyo, mga pabango at mga pampaganda, mga kemikal sa sambahayan, pati na rin ang pinakalaganap na mga pollutant ng tubig, hangin at mga panganib sa industriya, nanomaterial);

Pananaliksik sa larangan ng oncology;

Pag-aaral ng mga sistema ng pag-aayos ng DNA;

Ang pamamaraan ay batay sa pagpaparehistro ng iba't ibang kadaliang kumilos sa isang pare-parehong electric field ng nasirang DNA at/o mga fragment ng DNA ng mga indibidwal na lysed cell, na nakapaloob sa isang manipis na agarose gel sa isang standard glass slide. Kasabay nito, lumilipat ang cell DNA, na bumubuo ng isang electrophoretic na bakas na biswal na kahawig ng isang "buntot ng kometa", ang mga parameter na nakasalalay sa antas ng pinsala sa DNA. Matapos makumpleto ang electrophoresis, ang mga slide ay nabahiran at sinusuri gamit ang fluorescence microscopy.

Ang pagkuha ng imahe at pagpoproseso ng data ay isinasagawa gamit ang isang hardware-software complex, na kinabibilangan ng napakasensitibong camera na sinamahan ng isang mikroskopyo, at espesyal na software.

Ang unibersal na matalinong software na kasama sa kumplikadong ito ay nagbibigay ng:

Ang awtomatikong pagsusuri ng imahe ng mga kometa ng DNA na "isang keystroke", kasama ang lahat ng mga pangunahing parameter ng pagsukat kabilang ang % DNA sa buntot ng kometa;

- mataas na reproducibility;

Ang pagsusuri ng mga parameter ng DNA comets ay isinasagawa kapwa sa "real time" na mode at mula sa mga naka-imbak na digital na imahe;

Pinoproseso ng programa ang data at ipinapakita ang mga ito sa anyo ng isang protocol alinsunod sa mga internasyonal na kinakailangan ng GLP;

Pagsusuri at paghahambing ng datos;

Ang programa ay ganap na napatunayan at sumusunod sa mga internasyonal na kinakailangan ng GLP. May hierarchical access at data protection system.

Kasama sa kit ang:

1. Luminescent biomedical microscope Nikon Eclipse Ni-E.

2. 50W epi-fluorescent lighting system, filter-dichroic mirror-filter kit para sa DAPI, FITC, TRITC dyes.

3. Monochrome CCD IEEE1394 FireWire camera para sa luminescence. Basler Scout scA1300-32fm. Laki ng pixel - 3.75 µm x 3.75 µm. Resolution - 1296 px x 966 px. Laki ng sensor 1/3 pulgada. Matrix - Sony. Paglipat ng data sa pamamagitan ng high-speed port - 1394 BUS. Frame rate sa maximum na resolution - 32 frames / sec. Nagbibigay ng trabaho sa mga bagay sa real time

4. Comet Assay IV - isang software package para sa Windows na may spreadsheet generator para sa Microsoft Excel, para sa pagtatrabaho sa isang monochrome CCD IEEE1394 FireWire video camera sa real time (mga pagsukat at pagsusuri ay posible pareho sa isang video stream at sa mga litrato), isang pagtuturo manual at isang CD para i-install at patunayan ang program.

5. Isang taong lisensya para sa apat na user.

6. Distance learning sa pamamagitan ng Internet para sa apat na user.

Karagdagang inaalok:

1. Data operator na gumamit ng Comet Assay IV sa mga XML na bersyon ng mga database para sa paghahanap, pag-filter at pagkuha ng data at pag-audit sa pamamagitan ng secure na database ng Oracle na nakaimbak sa MS Excel na format para sa spreadsheet na trabaho. Kasama ang kakayahang tingnan ang mga awtomatikong na-save na larawan, mga lagda, naka-archive na data, at auto-audit na data. Bukod pa rito, kasama ang kakayahang mag-export ng hindi nalagdaan at digital na nilagdaang data sa XML na format. May kasamang Crypto-Key-Prove na nag-iisa upang tingnan ang digitally signed na data sa iba't ibang format.

2. Access ng manager sa GLP system. Ang Access Manager ay isang programa upang kontrolin at pamahalaan ang access ng empleyado sa mga database. Pinag-isang sistema para sa PI genetic toxicology. May kasamang komprehensibong pag-audit ng system. Panlabas na pag-audit. Pangangasiwa ng mga user account at aktibidad ng user na nauugnay sa mga program, access, password, rebisyon, atbp. Gumagamit ng Oracle para secure na protektahan ang mga user at data ng pag-audit. Buong pagsunod sa FDA 21 CFR Part 11 na mga huling tuntunin para sa mga electronic record at electronic signature.

3. Pagsasanay sa solong user batay sa mga instrumentong Perceptive sa UK

Ang mga indeks ng fragmentation ng DNA ay pinag-aralan ng paraan ng DNA comets sa alkaline modification sa ilalim ng mga kondisyon ng iba't ibang antas ng pagkakalantad sa radiation factor sa mga domestic na kondisyon. Ang volumetric na aktibidad (VA) ng radon, ang ambient equivalent dose rate (AEDR) ng gamma radiation at ang flux density ng beta radiation ay isinasaalang-alang. Ang average na halaga ng RA ng radon sa panloob na hangin ay 89.4 Bq/m3, ang halaga ng ADER ng gamma background ay 0.12 µSv/h, ang flux density ng beta radiation ay 0.6 s-1. Ang average na antas ng DNA fragmentation ay 3.48%. Ang antas ng fragmentation ng DNA sa 3 mga parameter (ang proporsyon ng DNA sa buntot ng kometa, ang haba ng buntot ng kometa, ang sandali ng buntot ng kometa) ay nadagdagan sa mga lalaki, ngunit ang kalakaran na ito ay hindi umabot sa istatistikal na kahalagahan. Ang mga parameter ng DNA comets ay hindi naiiba nang malaki depende sa pagbabago sa antas ng radon. Ang isang positibong ugnayan ay natagpuan sa pagitan ng pagganap ng mga kometa ng DNA at isang pagtaas sa kapangyarihan ng gamma radiation. Kasabay nito, ang ADER ng gamma radiation ay nasa loob ng mga limitasyon pinahihintulutang pamantayan sa lahat ng mga lugar na sinuri.

ionizing radiation

dna comets

alkaline modification ng dna comets

epekto ng mababang dosis ng radiation

1. Robertson A., Allen J., Laney R., Curnow A. Ang cellular at molecular carcinogenic effect ng radon exposure: isang review // Int. J. Mol. Sc., 2013, vol. 14, hindi. 7, pp. 14024-14063.

2. Druzhinin V.G., Sinitsky M.Y., Larionov A.V. et al. Pagtatasa ng antas ng mga chromosome aberrations sa peripheral blood lymphocytes sa mga pangmatagalang residenteng bata sa ilalim ng mga kondisyon ng mataas na pagkakalantad sa radon at mga produkto ng pagkabulok nito // Mutagenesis, 2015, vol. 30, pp. 677–683.

3. Singh N.P., McCoy M.T., Tice R.R., Schneider E.L. Isang simpleng pamamaraan para sa quantitation ng mababang antas ng pinsala sa DNA sa mga indibidwal na cell // Exp. Cell Res., 1988, vol. 175, pp. 184–191.

4. Azqueta A., Gutzkow K.B., Brunborg G., Collins A.R. Patungo sa isang mas maaasahang assay ng kometa: pag-optimize ng konsentrasyon ng agarose, oras ng pag-unwinding at mga kondisyon ng electrophoresis // Mutat. Res., 2011, vol. 724, hindi. 1–2, pp. 41-45.

5. Konca K., Lankoff A., Banasik A. et al. Isang cross platform public domain PC image analysis program para sa comet assay // Mutation Research, 2003, vol. 534, pp. 15-20.

6Glantz S.A. Primer ng Biostatistics / S.A. Glantz. – McGraw-Hill Medical, 7 edisyon, 2011. – 320 p.

7. Georgakilas A.G., O’Neill P., Stewart R.D. Induction at repair ng clustered DNA lesions: ano ang alam natin sa ngayon? // Radiat. Res., 2013, vol. 180, pp. 100–109.

8. Kaur S., Sangeeta, Galhna K.K., Gautam N. Pagsusuri sa pinsala sa DNA na sanhi ng radiation sa mga lymphocyte ng dugo sa paligid ng tao gamit ang COMET assay // Int. J. Life Sci. Scientifi. Res., 2017, vol. 3, hindi. 4, pp. 1208-1214.

9. Miklos M., Gajski G., Garaj-Vrhovac V. Paggamit ng pamantayan at binagong kometa assay sa pagtatasa ng pinsala sa DNA sa mga lymphocytes ng tao pagkatapos ng exposure sa ionizing radiation // Radiology and Oncology, 2009, vol. 43, hindi. 2, pp. 97-107.

10. Batar B., Guven M., Baris S. et al. DNA repair gene XPD at XRCC1 polymorphism at ang panganib ng childhood acute lymphoblastic leukemia // Leuk. Res., 2009, vol. 33.pp. 759–763.

11. Jiang J., Zhang X., Yang H., Wang W. Mga polymorphism ng DNA repair genes: ADPRT, XRCC1, at XPD at panganib sa cancer sa genetic epidemiology // Meth. Mol. Biol., 2009, vol. 471.pp. 305–333.

12. Larionov A.V., Sinitsky M.Yu., Druzhinin V.G. et al. DNA excision repair at double-strand break repair gene polymorphism at ang antas ng chromosome aberration sa mga bata na may pangmatagalang pagkakalantad sa radon // Int. J. Radiat. Biol., 2016, vol. 92, hindi. 8, pp. 466-474.

13. Wojewodzka M., Kruszewski M., Iwanenko T. et al. Kakulangan ng masamang epekto ng ugali sa paninigarilyo sa pagkasira ng strand ng DNA at pagkasira ng base, gaya ng ipinahayag ng alkaline comet assay // Mutat. Res., 1999, vol. 440, pp. 19–25.

14. Geric M., Gajski G., Orescanin V., Garaj-Vrhovac V. Mga pana-panahong variation bilang predictive factor ng mga parameter ng comet assay: isang retrospective na pag-aaral // Mutagenesis, 2017, doi:10.1093/mutage/gex023.

Ang epekto ng radon ay pinag-aralan nang mabuti sa hanay ng mataas na konsentrasyon. Ang itinatag na mga pamantayan sa kalinisan ay nagbibigay para sa isang antas ng katumbas na equilibrium volumetric activity (EEVA) na 200 Bq/m3 bilang limitasyon ng pinapayagang volumetric na aktibidad ng radon sa residential air. Kasabay nito, sa isang bilang ng mga bansa, ang pinahihintulutang antas ay nadagdagan sa 400 Bq/m3, na ipinaliwanag, una sa lahat, ng mga tampok na geological ng teritoryo. Sa kabilang banda, mayroong isang punto ng view sa pangangailangan na bawasan ang pinahihintulutang antas sa 2 pCu/l, na tumutugma sa 74 Bq/m3. Sa loob ng balangkas ng modernong paradigm ng WHO at ang prinsipyo ng isang linear na non-threshold na pagtaas sa mga epekto ng radiation, kahit na ang isang maliit na pagkakalantad sa radiation ay humahantong sa pagtaas ng panganib ng mga stochastic effect (pangunahin ang cancer).

Malinaw, ang maliliit na epekto ng radiation na nakakaapekto sa malalaking grupo ng mga tao ay maaaring humantong sa isang makabuluhang pagtaas sa lipunan sa saklaw ng kanser. Bilang resulta, tila napakahalaga na makaipon ng impormasyon sa mga epekto ng iba't ibang uri ng ionizing radiation sa maliliit na dosis, kung saan ang buong populasyon ng planeta ay nalantad sa isang antas o iba pa. Ang pagtaas sa radon EEVA sa itaas 200 Bq/m3 ay kinikilala bilang hindi kanais-nais para sa karamihan ng mga tinatanggap na pamantayan sa larangan ng radiation hygiene. Kasabay nito, 5-10% lamang ng mga lugar ng tirahan ang maaaring maiugnay sa mga lugar na may ganoong antas ng pagkakalantad. Ang antas ng volumetric na aktibidad (VA) ng radon sa 2 pCu/l (74 Bq/m3) at mas mataas ay maaaring maobserbahan sa 20-50% ng residential na lugar, depende sa uri ng pag-unlad at heograpikal na lokasyon. Malinaw, kahit na ang mababang intensity na pagkakalantad sa radon ay maaaring humantong sa isang makabuluhang pagtaas sa saklaw, dahil sa pandaigdigang sukat ng problema. Tila may kaugnayan sa pag-aaral sa epekto ng mababang dosis na pagkarga ng densely ionizing radiation sa katawan ng tao.

Ang Radon ay kasalukuyang kinikilala bilang isa sa mga pinaka-mapanganib na carcinogens na nakakaapekto sa mga tao. Sa likas na katangian, ang radiation radon factor ay hindi gumaganap ng isang mahalagang papel, dahil ang radon gas ay nagkakalat sa isang malaking dami ng hangin at mabilis na nabubulok (half-life Rn222 = 3.82 araw). Kasabay nito, ang mga gusali ng tirahan at teknikal ay isang uri ng mga bitag na nag-iipon ng radon (hanggang sa 10 beses kung ihahambing sa bukas na hangin). Radon foci ay madalas na sporadically matatagpuan, radon ay itinuturing na ang nangungunang sanhi ng pagtaas sa dalas ng chromosomal aberrations sa mga katulad na nakalantad na mga grupo.

Ang isa sa mga epektibong pamamaraan ng biomonitoring ay ang direktang pagtatasa ng antas ng pagkasira ng DNA sa mga selula ng dugo sa pamamagitan ng pamamaraang "DNA comet" (gel electrophoresis ng mga indibidwal na selula). Ang pamamaraang ito ay nagsasangkot ng lysis ng mga cell na inilagay sa isang agarose gel, habang ang DNA ay lumilipat sa isang electric field. Ang mga cell na may mas mataas na dalas ng double break ay nailalarawan sa pamamagitan ng pagtaas ng paglipat ng DNA sa anode. Noong 1988, iminungkahi ni Singh at mga kasamahan ang isang alkaline na pagbabago ng pamamaraan, kabilang ang isang hakbang ng lysis sa pH>13. Ang bersyon na ito ay makabuluhang pinatataas ang sensitivity ng pamamaraan, na nagpapahintulot sa pagtuklas ng mga solong break, alkali-labile na mga site, DNA-DNA at DNA-protein cross-link, pati na rin ang mga site ng hindi kumpletong pagkumpuni. Dahil ang mga epekto ng solong DNA break ay nangingibabaw para sa karamihan ng mga genotoxicant, ang alkaline na pagbabago ng pamamaraan ay naging posible upang makabuluhang taasan ang nilalaman ng impormasyon at sensitivity ng pagsubok. Ang isa sa mga pangunahing bentahe ay ang kakayahang makita ang mga epekto ng genotoxic sa ilalim ng mga kondisyon ng sabay-sabay na pagkilos ng mga kadahilanan ng cytotoxic na humahantong sa pagbuo ng mga karamdaman sa chromosomal, ngunit walang epekto ng genotoxic. Sa ilalim ng mga kondisyon ng pH>12, ang mga denatura ng DNA at ang mga hibla ay naluluwag dahil sa pagkasira ng mga bono ng hydrogen sa pagitan ng 2 helice. Sa pag-abot sa pH 12.6 alkaline labile sites, tulad ng apurine/apyrimidine sites, ay na-transform sa solong DNA break. Sa pH>13, ang pinakamataas na antas ng pagbabago ng alkali-labile na mga site ay nakakamit.

Mga materyales at pamamaraan

Halimbawang katangian

Pinunan ng bawat nasuri na tao ang isang personal na palatanungan, na kinabibilangan ng impormasyon tungkol sa edad, katayuan sa kalusugan, paggamit ng tabako at alkohol, mga panganib sa trabaho, mga pamamaraan ng diagnostic ng X-ray, paglalakbay sa himpapawid, pagbabakuna, at pag-inom ng gamot sa loob ng 3 buwan bago ang pagsusuri. Isang pangkat ng 39 na paksa na hindi nalantad sa mga potensyal na genotoxic na kadahilanan ay napili. Lahat ng sinuri ay wala pang 40 taong gulang. Isang kabuuan ng 18 lalaki (mean age 29 years) at 21 babae (mean age 31 years) ang sinuri.

Ang pag-aaral ay isinagawa alinsunod sa mga kinakailangan ng Commission on Ethics ng Kemerovo State University, ang protocol ng pag-aaral ay naaprubahan sa pulong ng Commission No. 4 na may petsang Oktubre 10, 2016. Ang bawat kalahok ay pumirma ng isang informed consent form na naglalaman ng impormasyon tungkol sa ang mga layunin ng pag-aaral.

Mga sample ng biomaterial

Ang mga sample ng venous na dugo ay nakolekta sa 4 ml na mga vacuum tube na naglalaman ng sodium-EDTA bilang isang anticoagulant. Ang materyal ay nakolekta mula Nobyembre 2016 hanggang Abril 2017. Sa loob ng 1-2 oras, ang mga sample ay dinala sa laboratoryo. Ang lahat ng mga sample ay na-code at naproseso. Ang pamamaraan ng DNA comet ay sinimulan kaagad pagkatapos dumating ang mga sample.

Gel electrophoresis ng mga indibidwal na selula (paraan ng DNA comet)

Ang paraan ng DNA comet ay isinagawa sa isang alkaline modification na binuo ni Singh et al. Ang unang layer ng gel ay isang 1% na solusyon ng karaniwang agarose (Applichem, USA). Ang mga cell ay nilagyan ng 1% mababang melting point agarose (Applichem, USA) sa 39 ° C. Ang 70 μl ng isang suspensyon ng mga selula ng dugo sa mababang natutunaw na agarose ay inilagay sa isang baso na may karaniwang agarose at inilagay sa yelo hanggang sa ganap na tumigas ang gel. Pagkatapos ng solidification, ang mga slide ay inilagay sa isang lysis buffer sa 4 ° C sa loob ng 12 oras. Ang komposisyon ng lysis buffer: 2.5 mol/l NaCl (Vekton, Russia), 0.1 mol/l Na2EDTA (Vekton, Russia), 1% Triton X-100 (Amresco, USA), 10% DMSO ( "Vekton", Russia ). Pagkatapos ng lysis, ang pahalang na electrophoresis (300 mA, 25 V, 30 min) ay isinagawa sa alkaline buffer (pH>13). Ang electrophoresis ay nauna sa 20 min. paggamot na may alkaline buffer (300 mM NaOH (Vekton, Russia), 1 mM Na2EDTA (Vekton, Russia). Ang lysis at electrophoresis ay isinasagawa sa 4°C sa kawalan ng direktang sikat ng araw. Pagkatapos ng electrophoresis, ang mga baso ay na-neutralize ng tatlong beses sa phosphate-buffered saline PBS pH 7.5 (Amresco, USA) Pagkatapos nito, ang mga slide ay ginagamot ng 70% ethanol sa loob ng 5 minuto, pinatuyo at nabahiran ng 50 μl ng isang solong SYBR GREEN (Biotech-Industriya, Russia).

Pagsusuri ng "comets"

Ang mga parameter ng fragmentation ay nasuri sa pamamagitan ng microphotography ng mga paghahanda na nabahiran ng SYBR GREEN gamit ang isang Zeiss Axio Imager 2 mikroskopyo. Isang kabuuan ng 100 random na piniling mga kometa mula sa bawat pinag-aralan na sample ay nakuhanan ng larawan sa x400 magnification. Ang kasunod na pagproseso ng mga litrato ay isinagawa gamit ang CASP software package. Ang mga parameter ng haba ng buntot ng kometa, sandali ng buntot, at ang bahagi ng DNA sa buntot ng kometa ay kinakalkula.

Paraang istatistikal

Ang pagtatasa ng data ng istatistika ay isinagawa gamit ang Statistica 10.0 package. Para sa mga marka, kinakalkula ang mga mean value at 95% na limitasyon sa pagitan ng kumpiyansa (CI 95). Ang mga paghahambing ng grupo ay ginawa gamit ang Mann-Whitney U-test. Ang antas ng kahalagahan ay kinuha sa antas ng 5%. Ang ugnayan sa pagitan ng mga panukala para sa kaso ng di-parametric na data ay kinakalkula gamit ang koepisyent ng ugnayan ng Pearson para sa mga ranggo. Kasabay nito, para sa mga sample ng higit sa 50 tao, ang halaga ng pagsusulit ng Estudyante ay kinakalkula din, batay sa halaga ng koepisyent ng ugnayan ng Pearson .

resulta

Ang bahagi ng DNA sa buntot ng kometa ay hindi lalampas sa 15%. Ang average na halaga ng volumetric na aktibidad (VA) ng radon sa panloob na hangin ay 89.4 Bq/m3, ang halaga ng AEDR ng gamma background ay 0.12 μSv/h, ang beta-radiation flux density ay 0.6 s-1. Ang antas ng fragmentation ng DNA sa 3 mga parameter ay nadagdagan sa mga lalaki, ngunit ang kalakaran na ito ay hindi umabot sa istatistikal na kahalagahan (Talahanayan 1).

Talahanayan 1

Mga tagapagpahiwatig ng pagkapira-piraso ng DNA sa mga sinuri na lalaki at babae

Ang antas ng 74 Bq/m3, na tumutugon sa 2 pCu/l ng hangin, ay pinili bilang antas ng hangganan ng radon RA sa hangin. Ang ibig sabihin ng VA ng radon ay 47 Bq/m3 sa unang grupo at 143 Bq/m3 sa pangalawang grupo. Ang pinakadakilang nilalaman ng impormasyon ay itinatag para sa tagapagpahiwatig ng sandali ng buntot ng mga kometa. Ang sandali ng buntot ay nakataas sa mas mataas na pangkat ng radon, ngunit ang kalakaran na ito ay hindi umabot sa antas ng istatistikal na kahalagahan (Talahanayan 2). Ang kalakaran na ito ay tipikal lamang para sa mga na-survey na lalaki.

talahanayan 2

Mga tagapagpahiwatig ng pagkapira-piraso ng DNA sa mga pangkat na pinag-iba ayon sa kasarian at radon OA

RA ng radon sa panloob na hangin, Bq/m3	% DNA sa buntot ng kometa	Haba ng buntot, µm	sandali ng buntot ng kometa

	3,65	13,73	0,94
	3,97	14,52	1,43

	3,30	13,21	0,88
	3,00	11,95	0,72

	3,43	13,42	0,90
	3,51	13,30	1,09

Ang isang posibleng pag-asa ng mga tagapagpahiwatig ng DNA sa magnitude ng ADER ng gamma radiation sa mga lugar ng tirahan ay sinisiyasat din. Para sa pagpapatunay, ang koepisyent ng ugnayan sa pagitan ng mga indeks ng pagkasira ng DNA at ang ADER ng gamma radiation ay kinakalkula. Ang isang positibong ugnayan ay natagpuan sa pagitan ng mga parameter ng DNA comets at isang pagtaas sa kapangyarihan ng gamma radiation (figure). Kasabay nito, ang ADER ng gamma radiation ay nasa loob ng mga pinapahintulutang limitasyon sa lahat ng sinusuri na lugar.

Pag-asa ng mga tagapagpahiwatig ng fragmentation ng DNA sa AEDR ng gamma radiation sa residential na lugar (r - Spearman correlation coefficient, p - probabilidad ng "null" hypothesis)

Pagtalakay

Pagkakalantad sa radiation

Ang ionizing radiation ay may kakayahang mag-udyok sa pagbuo ng mga kumpol ng pinsala sa DNA, na natanto sa anyo ng mga double-strand break at iba pang pinsala na malapit sa lugar. Ang bihira at densely ionizing radiation ay nagdudulot ng humigit-kumulang sa parehong bilang ng mga indibidwal na lesyon ng DNA sa bawat yunit ng absorbed dose, ngunit sa kaso ng densely ionizing radiation (alpha particle), ang mga lesyon na ito ay ipinamamahagi sa mas maliit na bilang ng mga rehiyon ng DNA, na nagpapahiwatig ng pagtaas sa ang bilang ng mga sugat sa kumpol; halimbawa, ang average na bilang ng mga pinsala sa isang cluster ay may posibilidad na tumaas sa linear na paglipat ng enerhiya. Ang gamma radiation, na naitala sa mga lugar ng paninirahan ng lahat ng sinuri, ay hindi lalampas sa mga regulated na halaga ng background. Ang mga pagbabago sa background ng gamma, malamang, ay sanhi ng mga tampok ng mga gusali at materyales sa gusali.

Pagsusuri ng "comets"

Ang paraan ng DNA comet ay isang simple at mabilis na pagsubok na mabisang sumusukat sa antas ng pinsala sa DNA at pagkumpuni ng pinsala pagkatapos ng pagkakalantad. Sa pag-aaral na ito, walang nakitang makabuluhang heterogeneity sa mga tuntunin ng antas ng pinsala sa DNA sa pinag-aralan na populasyon. Sa isang bilang ng mga gawa na nakatuon sa biological dosimetry, ang mga kahirapan sa pagbubunyag ng epekto ng mababang dosis ng radiation ay nabanggit nang mas maaga. Kasabay nito, sa karamihan ng mga pag-aaral, ang mga grupo ng mga taong nakalantad sa panlabas na radiation ay pinag-aralan. artipisyal na pinagmulan, halimbawa mga tauhan ng radiological at radiological installation.

Ang mga sukat ng mga rate ng fragmentation ng DNA ay maaaring magpakita ng parehong indibidwal na antas ng pinsala sa DNA at ang kakayahang ayusin ang pinsala sa radiation. Noong nakaraan, ang isang bilang ng mga pag-aaral ay nagtatag ng kakayahan ng mga gene sa pag-aayos upang baguhin ang dalas ng mga kaguluhan sa namamana na materyal. Ang naobserbahang pattern ng pagkasira ng DNA ay resulta ng balanse sa pagitan ng pinsala at pag-aayos ng DNA, at ang mababang antas ng pinsala o kakulangan ng malakas na ugnayan ay maaaring resulta ng parehong mababang pinsala at mataas na indibidwal na kahusayan sa pagkumpuni.

Ayon sa ilang mga pagtatantya, ang panahon ng taon (nadagdagan ang mga parameter sa tag-araw) at ang pagkakalantad sa medikal ay gumagawa ng pinakamalaking kontribusyon sa pagtaas ng mga tagapagpahiwatig ng DNA ng kometa para sa mga salik na hindi produksyon. Sa aming trabaho, ang mga salik na ito ay hindi maaaring magkaroon ng isang makabuluhang epekto, dahil ang koleksyon ng biological na materyal ay isinasagawa sa panahon ng taglamig ng taon, at lahat ng mga tao na sumailalim sa mga pagsusuri sa X-ray sa loob ng 3 buwan bago ang pag-aaral ay hindi kasama sa sample. . Ang kakulangan ng mga ugnayan sa dami ng konsentrasyon ng radon ay maaaring dahil sa maliit na laki ng sample. Sa hinaharap, pinlano na ipagpatuloy ang linyang ito ng pananaliksik na may pagtaas sa laki ng sample.

Konklusyon

Ang pag-aaral ng mga epekto ng pangmatagalang pagkakalantad sa mababang dosis ng radiation ay isang mahirap na gawain; ang pangangailangan na pumili ng mga sample at kontrolin ang magkakatulad na mga kadahilanan ay maaaring masira ang larawan. Sa ipinakita na pag-aaral, hindi posible na matukoy ang mga makabuluhang ugnayan sa istatistika na may mga tagapagpahiwatig ng aktibidad ng dami ng radon, ngunit sa parehong oras, ang mga nakitang ugnayan na may mga tagapagpahiwatig ng background ng gamma ay nagpapahiwatig ng mga prospect ng pag-aaral na ito. May malinaw na pangangailangang suriin ang kadahilanan ng kahusayan sa pagkukumpuni ng mga sinuri para sa ganitong uri ng pag-aaral, na gagawing posible na makilala at maihambing ang mga taong may katulad na katangian ng pagkumpuni.

Walang mga salungatan ng interes na nauugnay sa pag-aaral na ito.

Ang pag-aaral ay sinusuportahan ng Russian Foundation for Basic Research (no. 16-34-60069\15 mol_a_dk).

Bibliograpikong link

Larionov A.V., Volobaev V.P., Serdyukova E.S. PAG-AARAL NG DNA-COMET INDICATORS SA MGA HEALTHY DONORS SA ILALIM NG IBA'T IBANG RADIATION PARAMETER NG RESIDENTIAL PREMISES // Mga Makabagong Problema ng Agham at Edukasyon. - 2017. - Hindi. 6.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=27215 (petsa ng access: 02/01/2020). Dinadala namin sa iyong pansin ang mga journal na inilathala ng publishing house na "Academy of Natural History"

Ang mga hayop at ang kanilang mga supling ay patuloy na nagdaragdag at nagdaragdag ng bilang ng mga aso at pusa na walang tirahan, kaya ang kontrol sa kanilang pagpaparami ay isa sa mga kinakailangang kondisyon para mabawasan ang bilang ng mga taong walang tirahan, samakatuwid, kinakailangan na bumuo ng mga patakaran para sa pag-aalaga ng mga alagang hayop;

Bumuo ng mga regulasyon o tagubilin para sa paghuli, pagdadala, pag-sterilize, pag-iingat, pagtatala at pagpaparehistro ng mga ligaw na hayop;

Kapag nanghuhuli ng mga aso, kinakailangang gumamit ng mga modernong paraan ng pagpigil sa paggalaw ng mga biological na bagay at pag-immobilize ng mga hayop gamit ang isang "flying syringe" gamit ang non-inhalation anesthesia;

Gumawa ng mga silungan para sa pag-iingat ng mga ligaw na aso at mga ospital para sa kanilang isterilisasyon;

Ang euthanasia ng mga hindi mabubuhay na hayop upang wakasan ang pagdurusa ay dapat isagawa lamang ng isang beterinaryo na nagtatrabaho

UDC 577.323:576.385(591+581)

sa mga organisasyong may lisensya para sa mga aktibidad na medikal at pang-iwas.

Lumikha ng isang espesyal na crematorium para sa pagtatapon ng mga patay na napabayaang hayop at mga alagang hayop, dahil ang anumang paglilibing ng mga hayop ay ipinagbabawal ng mga pamantayan sa kalusugan, ang mga naturang sementeryo ay nanganganib na maging mga hotbed para sa pagkalat ng mga nakakahawang sakit.

Panitikan

1. Kolya G. Pagsusuri ng mga Populasyon ng Vertebrate. - M.: Mir, 1979. - 362 p.

2. Vereshchagin A.O., Poyarkov A.D., Goryachev K.S. Mga pamamaraan para sa pagtantya ng bilang ng mga ligaw na aso sa lungsod // Tez. mga ulat ng VI Congress of the Theriological Society. - M., 1999. - 47 p.

3. Chelintsev N.G. Mga pundasyon ng matematika ng accounting ng hayop. - M., 2000. - 431 p.

Natanggap noong 03/22/2014

Gamit ang pamamaraang "DNA comet" upang matukoy at masuri ang antas ng pagkasira ng DNA sa mga selula ng mga organismo ng halaman, hayop at tao na dulot ng mga salik sa kapaligiran (review)

E.V. Filippov

Ang epekto ng masamang mga kadahilanan sa kapaligiran sa anumang biological system (single-celled, halaman, hayop, tao) ay sinamahan ng akumulasyon ng pinsala sa DNA at mga pagbabago sa aktibidad ng mga sistema ng pag-aayos, na maaaring humantong sa mga mutasyon at pathological na pagbabago sa cell at ang buong organismo. Sinusuri ng pagsusuri ang pagiging epektibo ng paraan ng "DNA comet" para sa pag-detect ng pinsala sa DNA na dulot ng iba't ibang mga kadahilanan sa kapaligiran: radiation, non-ionizing radiation, kemikal, mental (para sa mga tao). Ang pamamaraan at metodolohikal na pundasyon ng pamamaraan ay inilarawan. Ang pamamaraan ay may sensitivity na kinakailangan upang makita ang pinsala sa DNA sa antas ng isang indibidwal na cell at maaaring magamit upang masuri ang integral na integridad ng genome. Mga larangan ng aplikasyon ng pamamaraang "DNA comet": pagtatasa ng "kalidad ng buhay" ng anuman biyolohikal na sistema sa ilang mga ekolohikal na kondisyon ng tirahan; biomonitoring, gamot, sa partikular na oncology, toxicology, pharmacology, epidemiology at marami pang iba.

Mga pangunahing salita: pinsala sa DNA, mutasyon, pagkumpuni, apoptosis, genotoxicity, mga nakakahawang sakit, oncology.

Ang impluwensya ng masamang mga kadahilanan ng kapaligiran sa anumang biological system (unicellular, halaman, hayop, tao) ay sinamahan ng akumulasyon ng mga pinsala sa mga cell DNA at pagbabago ng aktibidad ng mga sistema ng reparation na maaaring humantong sa paglitaw ng mga mutasyon at pathological na pagbabago sa cell at isang pinagsamang organismo . Ang pagtatasa ng kahusayan ng paraan ng "DNA comets" para sa pagtuklas ng mga pinsala sa DNA na dulot ng iba't ibang mga kadahilanan sa kapaligiran - radioactive, hindi ionizing radiation, kemikal, mental (para sa tao) ay ipinakita sa pagsusuri. Inilarawan ang metodolohikal at metodolohikal na mga batayan ng pamamaraan. Ang pamamaraan ay may sensitivity na kinakailangan para sa pagpaparehistro ng mga pinsala sa DNA sa antas ng isang cell, at maaaring ilapat para sa pagtatasa ng pinagsama-samang integ-

FILIPPOV Eduard Vasilievich - Ph.D., senior researcher IPC SB RAS, [email protected]

rity ng isang genome. Saklaw ng isang paraan ng "DNA comets": pagtatasa ng "kalidad ng buhay" para sa anumang biological system sa anumang ekolohikal na kondisyon ng tirahan; biomonitoring, gamot, sa partikular na oncology, toxicology, pharmacology, epidemiology, atbp.

Mga pangunahing salita: mga pinsala sa DNA, mutation, reparation, apoptosis, genetic toxicity, mga nakakahawang sakit, oncology.

Sa kasalukuyan, kilalang-kilala na sa ilalim ng impluwensya ng iba't ibang mga kadahilanan sa kapaligiran (kemikal, pisikal, atbp.) Sa hanay ng intensity ng mga impluwensya na naiiba sa biological na pinakamainam ng mahahalagang aktibidad, ang genome ng mga organismo ay negatibong naapektuhan. Ito ay maaaring mangyari kapwa dahil sa direktang pagkilos, halimbawa, sa kaso ng pinsala sa mga molekula ng DNA sa pamamagitan ng ionizing radiation ayon sa "target" na prinsipyo, at hindi direkta, dahil sa mga libreng radical at reaktibo na species ng oxygen na nabuo sa cell. Karamihan sa mga pinsalang nabuo sa mga molekula ng DNA ay inaayos ng mga sistema ng pag-aayos, ngunit kung ang negatibong presyon ay mataas, ang pinsala ay naiipon at ito ay maaaring humantong sa mga nakapirming mutasyon, oncogenesis, o pagkamatay ng cell. Ang pagbuo ng pinsala sa DNA ay isang mahalagang kaganapan sa pagsisimula sa pagbuo ng mga proseso ng pathological sa katawan. Kaugnay nito, ang pagtuklas ng pinsala sa istraktura ng DNA sa mga unang yugto, kapag ang mga proseso ng pathological sa katawan ay hindi pa nagsimula at, nang naaayon, ay hindi masuri sa antas ng physiological, ay may partikular na kaugnayan. Sa kabila ng malawak na iba't ibang mga pamamaraan na ginagamit sa agham upang pag-aralan ang istraktura ng DNA, hindi lahat ng mga ito ay may sapat na sensitivity at specificity para sa pagsubaybay sa pinsala ng DNA, na ginagawang posible upang masuri ang pathogenetic na epekto ng mga kadahilanan sa vivo.

Kamakailan lamang, isang paraan ng pagsusuri ng pinsala sa DNA ay binuo na naaangkop sa parehong in vitro at in vivo. Tinawag itong "DNA-comet assay" na pamamaraan; una itong inilarawan nina Ostling at Johansson noong 1984. Ang mga pagpapabuti at pagbabago ng pamamaraang "DNA comet" ay naging posible upang makabuluhang taasan ang sensitivity nito at palawakin ang saklaw nito.

Ang isang medyo malawak na pagsusuri ng aplikasyon ng pamamaraan sa iba't ibang larangan ng medikal na agham ay ibinibigay sa trabaho. Sa kasalukuyan, ang pamamaraan ay malawakang ginagamit sa mga pag-aaral ng genotoxicity ng mga kemikal, ang aktibidad ng mga sistema ng pag-aayos ng DNA at apoptosis, sa mga klinikal na pag-aaral sa prenatal diagnosis, predisposition sa cancer, pagsubaybay sa pagiging epektibo ng therapy.

may cancer, katarata, atbp. Ang pamamaraang "DNA comet" ay nagiging mahalagang bahagi ng mga programa ng biomonitoring - pagtatasa ng epekto sa katawan ng diyeta, mga kadahilanan sa kapaligiran, kabilang ang ionizing radiation at "electromagnetic smog", mga pagbabago sa metabolismo at physiological state, pagtanda ng katawan, akumulasyon at pagkumpuni ng pinsala sa DNA; pananaliksik sa kapaligiran. Ang paggamit ng pamamaraang "DNA comet" ay ginagawang posible na pag-aralan ang akumulasyon ng pinsala sa DNA at ang aktibidad ng mga sistema ng pag-aayos nito sa halos anumang mga eukaryotic na selula, halimbawa, mga selula ng cyanobacteria, halaman, hayop, at tao.

Ang pamamaraan ay batay sa gel electrophoresis ng mga single lysed cells. Sa kasong ito, ang mga molekula ng DNA ay ipinamamahagi sa mga pores ng gel sa ilalim ng impluwensya ng isang electric field, at ang mga track ng DNA ay nakikita sa pamamagitan ng paglamlam ng isang fluorescent dye, pagkatapos kung saan ang mga sample ay sinusuri nang mikroskopiko. Sa pagkakaroon ng mga break ng DNA, ang istrukturang organisasyon ng chromatin ay nabalisa at ang DNA supercoiling ay nawala, na humahantong sa pagpapahinga nito, at ang mga fragment ng DNA ay nabuo. Sa isang electric field, ang mga nakakarelaks na loop at mga fragment ng DNA ay nakaunat patungo sa anode, na nagbibigay sa mga naobserbahang bagay ng hitsura ng "mga kometa" (kaya ang pinagmulan ng pangalang "comet assay", na naging karaniwang ginagamit). Ang "Comets" ay sinusuri alinman sa pamamagitan ng visual na pagmamasid at ang kanilang pagkakaiba ayon sa antas ng pagkasira ng DNA, o gamit ang computer image processing software.

Sa kasalukuyan, karamihan sa mga laboratoryo na nagpatupad ng pamamaraang ito sa pananaliksik ay nakabuo ng maraming mga pagkakaiba-iba ng protocol, sa partikular, sa mga tuntunin ng tagal at kondisyon ng cell lysis, denaturation, electrophoresis, at paglamlam ng DNA. Ang mga metodolohikal na aspeto ng mga tampok ng paggamit ng mga pagkakaiba-iba ng pamamaraan ay lubos na inilarawan sa mga gawa. Kasama sa pangkalahatang pamamaraan ng pamamaraan ang paghahanda ng isang suspensyon ng mga cell sa ilalim ng pag-aaral, paghahanda ng mga gel slide na may isang agarose substrate, paglalagay ng mga cell sa agarose gel, aplikasyon sa gel slide, lysis, alkaline denaturation sa alkaline na bersyon ng pamamaraan, electrophoresis , fixation/neutralization, staining at microscopic analysis (Fig. 1).

kanin. 1. Scheme ng aplikasyon ng "DNA comet" na paraan

Ang paghahanda ng mga cell suspension ay isa sa mga pangunahing hakbang sa pamamaraang "DNA comet". Sa kasong ito, ang isang bilang ng mga pamamaraan para sa pagkuha ng mga nakahiwalay na mga cell ay ginagamit: enzymatic na paggamot na may mga protease (trypsin, collagenase), mekanikal na disaggregation ng mga tisyu, paghihiwalay sa mga lamad o homogenization.

Kapag tinatasa ang genotoxicity ng mga environmental factor sa mga organismo ng hayop gamit ang DNA comet method in vitro, ginagamit ang mga cell ng primary at transplanted human cell culture (peripheral blood lymphocytes at human fibroblasts, HeLa cervical carcinoma, A-549 lung carcinoma, at laryngeal carcinoma) tradisyonal na ginagamit sa genotoxicological na pag-aaral. Hep2, atbp.). Tomas Gichner et al. sa pag-aaral ng epekto ng mga mabibigat na metal sa mga halaman, ang mga punla ay natupok sa isang daluyan na may mga cadmium salts, pagkatapos ay ang mga cell ng mga tip ng mga ugat at dahon ng mga punla ay pinaghiwalay at inilipat sa isang buffer solution, immobilized sa mga slide, lysed , at sinuri sa alkaline at neutral na mga bersyon ng DNA comet method. Ang iba't ibang variation sa yugtong ito ng pag-aaral ay hindi limitado at nakadepende lamang sa setting ng mga gawain at layunin ng pananaliksik.

Micropreparation at lysis.

Ang mga slide ng gel ay mga slide na pinahiran ng normal na melting point na agarose. Ayon sa kaugalian, ang mga slide na ginagamit sa mikroskopya na may frosted na guhit ay ginagamit upang ilapat ang mga inskripsiyon sa 1/4 ng ibabaw. Ang mga pinag-aralan na mga cell ay hindi kumikilos sa mababang natutunaw na agarose at inilapat sa salamin. Sa proseso ng lysis, sa ilalim ng pagkilos ng isang mataas na konsentrasyon ng NaCl at detergent, nangyayari ang dissociation ng mga istruktura ng cellular; pinupuno ng deproteinized DNA ang lukab na nabuo ng cell sa agarose.

Alkaline denaturation at electrophoresis. Sa neutral na bersyon ng pamamaraan, pagkatapos ng lysis, ang mga micropreparasyon ay sumasailalim sa electrophoresis sa isang neutral na buffer, kung saan ang DNA sa anyo ng mga strands at mga loop ng double-stranded DNA ay lumipat sa mga pores ng agarose sa anode, na bumubuo ng isang electrophoretic tail. . Sa alkaline na bersyon ng pamamaraan, ang isang karagdagang hakbang ng alkaline denaturation at ang electrophoresis mismo ay isinasagawa sa isang alkaline medium (pH>13). Sa panahon ng alkaline denaturation, ang DNA ay nagiging single-stranded, at ang alkali-labile na mga site ay na-convert sa single-stranded break. Sa panahon ng electrophoresis sa parehong buffer, ang nagreresultang solong-stranded na DNA at mga fragment ng DNA ay lumilipat sa anode, na bumubuo ng buntot ng kometa, kung saan, pagkatapos ng neutralisasyon/fixation, sila ay random na muling nagbabalik sa double-stranded na DNA.

Kaya, ang paggamit ng alkaline na bersyon ng "DNA comet" na pamamaraan ay ginagawang posible na suriin ang pangunahin ang ani ng mga single-strand break at alkali-labile na mga site, dahil ang double-strand break ay nagkakahalaga ng mas mababa sa 5% ng kabuuang ani ng Pagkasira ng DNA gamit ang protocol na ito. Ang pamamaraang "DNA comet", na isinasagawa sa ilalim ng mga neutral na kondisyon sa kapaligiran, ay nakakakita ng mga double-stranded na break ng DNA.

Microscopy at pagsusuri. Ang mga micropreparasyon pagkatapos ng neutralization/fixation at paglamlam ng mga slide ay sinusuri sa isang epifluorescent microscope na may naaangkop na mga filter ng dye sa 200-400-fold na magnification, depende sa uri ng cell. Ang pagsusuri sa mga kometa ng DNA ay maaaring isagawa nang biswal o gamit ang isang software at hardware complex. Sa visual na pamamaraan, ang mga kometa ng DNA ay niraranggo sa limang uri ng kondisyon (Larawan 2, A) na may katumbas na halagang numero mula 0 hanggang 4 para sa bawat isa.

Ang antas ng pinsala sa DNA sa kasong ito ay ipinahayag bilang isang index ng DNA comets (IDK), na tinutukoy ng formula:

CC4SP - -~-TJDi1U1

Hindi. Sh "V * - AN-™ tsuA - 1"

b fe££ F ___1

kanin. 2. DNA comets ng mga cell na may iba't ibang antas Pagkasira ng DNA (A) at pagsusuri ng kanilang mga digital na imahe sa kapaligiran ng software ng CASP (B). Ang mga numerical value para sa bawat uri ng DNA comet na ginamit sa visual analysis ng micropreparations ay ipinahiwatig.

IDK = (0xn0 + 1xnj + 2xn2 + 3xn3 + 4xn4) / I,

kung saan ang n0-n4 ay ang bilang ng mga DNA comets ng bawat uri, ang I ay ang kabuuan ng mga nasuri na DNA comets.

Ang software at hardware complex ay binubuo ng napakasensitibong CCD camera na sinamahan ng isang mikroskopyo at espesyal na software, na nagbibigay-daan sa digital recording at pagproseso ng mga parameter ng DNA comet na nagpapakilala sa integridad ng istruktura ng DNA: DNA comet length, tail length, head diameter, percentage ng DNA sa ulo o buntot (% DNA), atbp. (Larawan 2b). Ang haba ng buntot, ang porsyento ng DNA sa buntot, o ang kanilang produkto, ang tinatawag na tail moment, ay kadalasang ginagamit bilang indicator ng pagkasira ng DNA. Mayroong mataas na antas ng ugnayan sa pagitan ng mga resulta ng visual at software-hardware na pamamaraan para sa pagsusuri ng mga kometa ng DNA.

Pagtatasa ng pagkamatay ng cell. Ang mga micropreparations ng DNA comets ay kadalasang naghahayag ng mga hindi tipikal na DNA comets na may wala o halos wala na ulo at malawak, nagkakalat na buntot, na tinatawag na mga ghost cell o hedgehog. Ang mga ito ay pinili sa isang hiwalay na kategorya at hindi kasama sa pangkalahatang pagsusuri, dahil

kung magkano ang DNA sa buntot ng naturang mga kometa ay ipinakita sa anyo ng mga maikling discrete fragment (Larawan 3a).

Ipinapalagay na ang gayong mga kometa ng DNA ay maaaring bumuo ng mga apoptotic na selula sa yugto ng pagkapira-piraso ng chromatin, na nakumpirma sa eksperimento.

Ang mga kometa ng DNA na may katulad na morpolohiya ay matatagpuan sa pagsusuri ng mga selulang nakalantad sa mga ahente ng cytotoxic, tulad ng hydrogen peroxide (Larawan 3b). Ang mekanismo ng kanilang paglitaw ay hindi malinaw, ipinapalagay na ang DNA fragmentation ay nangyayari dahil sa "oxidative stress" at ang pag-atake ng DNA molecule ng reactive oxygen species. Ang bimodal na pamamahagi ng mga hindi tipikal na DNA comets at DNA comets na may mababang antas ng pinsala sa DNA ay nagpapahiwatig ng isang cytotoxic effect. Ang mga kometa ng DNA ng mga necrotic cell ay may ibang morpolohiya. Ang mga ito ay malapad, kadalasang hindi regular ang hugis ng DNA na mga kometa na may mga ulo at buntot na mahirap ibahin (Fig. 3c).

Kaya, ang pamamaraang "DNA-comet" ay ginagawang posible upang matukoy, kasabay ng pagkasira ng DNA, ang apoptogenic at cytotoxic na aktibidad ng mga pinag-aralan na ahente. Ang mga posibilidad ng pamamaraan ay hindi limitado sa kahulugan ng mga discontinuities

kanin. 3. DNA comets ng apoptotic (A, ipinahiwatig ng *), cytotoxic (B, ipinahiwatig ng *), at necrotic (C, na ipinahiwatig ng isang arrow) na mga cell. Pagpinta ng SYBR Green I, magnification x200

Ang DNA bilang mahalagang tagapagpahiwatig ng kanilang pinsala. Sa naaangkop na pagbabago, ang pamamaraang ito ay maaaring gamitin upang partikular na masuri ang iba't ibang uri ng pinsala sa DNA, na lubos na nagpapalawak ng pagiging angkop nito.

Pagsusuri ng binagong mga base ng DNA. Ang pagbabago ng paraan ng DNA comet para sa pagtatasa ng mga nasirang base sa DNA ay tinatawag na Comet FLARE (Fragment Length Analysis gamit ang Repair Enzymes). Ang kakanyahan nito ay nakasalalay sa paggamot ng DNA ng mga lysed na selula sa mga micropreparasyon na may mga tiyak na enzyme sa pag-aayos na nagpapakilala ng mga break sa DNA sa mga site ng lokalisasyon ng mga nasirang base.

Gamit ang enzyme formamidopyrimidine-DNA glycosylase (Fpg), ang antas ng oxidized guanine (8-oxoGua, FapyGua), formamidopyrimidines - pyrimidine base na may bukas na singsing, at isang bilang ng mga alkylated base ay tinasa. Ang paggamit ng glyco-

Ang sylase hOGG1 ay nagbibigay-daan sa tiyak na pagpapasiya ng 8-oxoG. Ang mga protocol ay binuo din upang suriin ang mga pyrimidine dimer sa DNA gamit ang pyrimidine dimer glycosylases (T4-PDG o cv-PDG), 6,4 photoproducts gamit ang S. Pobe UVDE, at mismatched uracil gamit ang uracil-DNA glycosylase (UDG). ) .

Pagtatasa ng DNA-DNA at DNA-protein crosslinks. Upang matukoy ang pagkakaroon ng DNA-protein cross-links, ang DNA-lysed cells ay ginagamot sa proteinase K. Ito ay humahantong sa isang pagtaas sa electrophoretic mobility ng DNA sa gel dahil sa pagkasira ng mga cross-link sa pagitan ng DNA at histone proteins hindi nasira sa panahon ng lysis. Ayon sa ratio ng mga tagapagpahiwatig na may at walang paggamot sa enzyme, ang porsyento ng mga crosslink sa DNA ay tinutukoy.

Upang masuri ang mga cross-link ng DNA-DNA, ang mga micropreparasyon pagkatapos ng lysis ay nakalantad sa radiation o mataas na konsentrasyon ng hydrogen peroxide, na nagpapataas sa paunang pinsala sa DNA. Kasabay nito, ang DNA na naglalaman ng DNA-DNA cross-links ay lumilipat sa mas mababang lawak sa panahon ng electrophoresis. Ang porsyento ng DNA-DNA crosslinks ay kinakalkula mula sa ratio ng mga pagbabago sa mobility ng control at pagsubok ng DNA pagkatapos ng pagproseso.

Pagtatasa ng DNA methylation. Upang masuri ang mga antas ng DNA methylation sa pamamagitan ng pamamaraang "DNA comet", ang Hpa11 restriction enzyme na sensitibo sa methylation ng internal cytosine sa CCGG sequence at MspI restriction enzyme na hindi sensitibo sa ganitong uri ng methylation ay ginagamit. Ang porsyento ng methylation ng mga isla ng CpG DNA ay tinutukoy ng formula:

100 - [(Hpa11^p1) 100],

kung saan ang HpaI/MspI ay ang porsyento ng DNA sa buntot pagkatapos ng paggamot sa DNA ng mga lysed cell na may kaukulang restriction enzyme.

Ang mga eksperimento ay nagpapakita ng mataas na pagkakapareho ng mga resulta sa data na nakuha ng tradisyonal na pamamaraan para sa pagtatasa ng methylation sa pamamagitan ng pagsasama ng may label na cytosine. Sa binanggit na gawain, ginamit ang alkaline na bersyon ng pamamaraan. Ipinakita ng mga eksperimento na ang paggamit ng neutral na electrophoresis para sa pagbabagong ito ng pamamaraang "DNA-comet" ay mas katanggap-tanggap, dahil ang mga paghihigpit ay nagpapakilala ng eksklusibong double break sa DNA.

Application ng "DNA-comet" na paraan sa pag-aaral ng genotoxic effect ng mga kemikal. Ang mga posibilidad ng pamamaraang "DNA-comet", ang mga pakinabang at kawalan nito ay malinaw na ipinakita sa gawain sa pag-aaral ng genotoxicity ng 208 na mga kemikal na compound,

kinuha mula sa iba't ibang grupo ng mga carcinogens na inuri ng International Agency for Research on Cancer at ng US National Toxicology Program. Isinagawa ang pagsubok sa mga daga (8 organo) at ipinakita ang mga pakinabang ng pamamaraang ito na nauugnay sa kakayahang matukoy ang pinsala sa DNA sa anumang organ, anuman ang antas ng aktibidad ng mitotic dito. Ang mga resulta ng pagsubok ay nagpakita na ang pamamaraan ay pinaka-epektibo sa pagtukoy ng pagkapira-piraso ng mga molekula ng DNA, na nabuo bilang isang resulta ng mga single-strand break na dulot ng mga kemikal, at mula sa alkali-labile na mga site na nangyayari sa panahon ng base alkylation at pagbuo ng mga adduct ng DNA. . Ang paghahambing ng paraan ng DNA comet sa Ames test, na isang karaniwang tinatanggap na paraan para sa pag-screen ng mga genotoxic substance, ay nagsiwalat ng mataas na antas ng ugnayan sa pagitan ng mga resultang nakuha kapag sinusuri ang mga carcinogenic at non-carcinogenic compound. Ang mga pag-aaral ng carcinogenicity ng mga substance (na nagpakita ng negatibong resulta ayon sa Ames test) gamit ang DNA comet method ay nagpakita na kalahati ng mga ito ay genotoxic. Ang huli ay nagpapahiwatig ng mga limitasyon ng parehong mga pamamaraan, muli na nagpapahiwatig na ang mga pamamaraan na nagpapahintulot sa pagtuklas ng pinsala sa DNA ay hindi gaanong ginagamit para sa pagkilala ng mga non-genotoxic carcinogens. Malinaw, walang iisang paraan na may kakayahang makita ang lahat ng genotoxic effect. Samakatuwid, karaniwang tinatanggap ang paggamit ng in vivo at in vitro test kit.

Konklusyon

Ang pamamaraang "DNA comet" ay may ilang makabuluhang pakinabang sa iba pang mga pamamaraan para sa pagtatasa ng pinsala sa DNA. Ang mga ito ay mataas na sensitivity, ang kakayahang makita ang pinsala sa DNA sa mga selula ng anumang tissue sa vivo, ang pinakamababang halaga ng pang-eksperimentong materyal na kinakailangan, medyo mababa ang gastos, at mataas na "plasticity", na, na may maliliit na pagbabago, ay nagbibigay-daan sa pamamaraan na gamitin para sa. piling pagpaparehistro ng iba't ibang kategorya ng pinsala sa DNA at mga nauugnay na kaganapan. Ang bilis ng mga eksperimento at ang relatibong pagiging simple ng protocol ng laboratoryo ay kaakit-akit. Ngayon, mayroong isang pinagkasunduan sa pangangailangan na isama ang paraan ng "DNA comet" bilang isang indicator test sa sistema ng pagsusuri ng eksperto ng genotoxicity sa vitro at in vivo. Sa Russia, ang pamamaraang ito ay naging bahagi ng isang bilang ng mga rekomendasyon at patnubay sa pamamaraan.

Bilang karagdagan, kinakailangang ituro ang posibilidad ng paggamit ng pamamaraang "DNA-comet" bilang isang indicator test sa epidemiological, iba't ibang uri ng eksperimental at klinikal na pag-aaral sa pag-aaral ng etiopathogenetic na papel ng pangunahing pinsala sa DNA, pati na rin para sa pagtatasa ng "kalidad ng buhay" ng isang biological system sa iba't ibang kondisyon sa kapaligiran.kondisyon sa kapaligiran.

Ang standardisasyon ng mga pamamaraan para sa pagsasagawa ng "DNA comet" na pamamaraan ay mahalaga upang matiyak ang convergence ng mga resulta na nakuha ng iba't ibang mga mananaliksik at upang maiwasan ang mga sitwasyon na nagdudulot ng hindi maliwanag at/o maling data sa mga eksperimento.

Panitikan

1. Kuzin A.M. Structural-metabolic theory sa radiobiology. - M.: Nauka, 1986. - 283 p.

2. Meyerson F.Z. Adaptation, stress at pag-iwas. - M.: Nauka, 1981. - 278 p.

3. Ang kometa assay sa toxicology / Dhawan A. at Anderson D. (Eds.); RSC Publisher, UK, London, 2009.

4 Collins A.R. Ang pagsusuri ng kometa para sa pinsala at pagkumpuni ng DNA: mga prinsipyo, aplikasyon at limitasyon // Mol Biotech. - 2004. - V. 26. - P. 229-261.

5. Ostling O., Johanson K.J. Microelectrophortic na pag-aaral ng radiation-induced DNA damage sa mga indibidwal na mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. -1984. - 123. - S. 291-298.

6. Olive P.L., Banath J.P. Ang comet assay: isang paraan upang masukat ang pinsala sa DNA sa mga indibidwal na selula // Nat Protoc. - 2006. - 1 (1). - S. 23-29.

7. Sorochinskaya U.B., Mikhailenko V.M. Application ng "DNA comet" na paraan upang masuri ang pinsala sa DNA na dulot ng iba't ibang mga ahente sa kapaligiran // Oncology. - 2008. - V.10, No. 3. - S. 303-309.

8. Durnev A.D., Zhanataev A.K., Anisina E.A. Application ng paraan ng alkaline gel electrophoresis ng mga nakahiwalay na cell upang masuri ang mga genotoxic na katangian ng natural at sintetikong compound: mga alituntunin. - M., 2006. - 28 p.

9. Zhanataev A.K., Nikitina V.A., Voronina E.S., Durnev A.D. Metodolohikal na aspeto ng pagtatasa ng pinsala sa DNA gamit ang pamamaraang "DNA comet" // Applied Toxicology. - 2011. - V.2, No. 2 (4). - S. 28-37.

10 Hartmann A. et al. Mga rekomendasyon para sa pagsasagawa ng in vivo alkaline comet assay // Mutagenesis. -2003. - V. 18. - R. 45-51.

11. Kumaravel T.S., Vilhar B., Stephen P. et al. Mga sukat ng Comet Assay: isang pananaw // Cell Biol. Toxicol. - 2009. - 25 (1). - P. 53-64.

12. Pagsusuri ng genotoxic properties sa pamamagitan ng in vitro DNA comet method: mga alituntunin. - M.: Federal Center for Hygiene and Epidemiology ng Rospotrebnadzor, 2010.

13. Tomás Gichner, Zde^nka Patková, Ji "rina Száko-vá, Kate" rina Demnerová. Ang Cadmium ay nagdudulot ng pinsala sa DNA sa mga ugat ng tabako, ngunit walang pinsala sa DNA, somatic mutations o

homologous recombination sa mga dahon ng tabako // Mutation Research. - 2004. - 559. - C. 49-57.

14 Olive P.L. Ang pinsala at pagkumpuni ng DNA sa mga indibidwal na selula: mga aplikasyon ng comet assay sa radiobiology // Int J Radiat Biol. - 1999. - 75. - C. 395-405.

15. Xie H., Wise S.S., Holmes A.L. et al. Ang carcinogenic lead chromate ay nag-uudyok ng DNA double-strand break sa mga selula ng baga ng tao // Mutat Res. - 2005. - 586 (2). -C. 160-172.

16. Yasuhara S., Zhu Y., Matsui T. et al. Paghahambing ng comet assay, electron microscopy at flow cytometry para sa pagtuklas ng apoptosis // Journal Histochem. Cytochem. - 2003. - 51 (7). - P. 873-885.

17. Olive P.L., Banath J.P. Pag-size ng mataas na fragmented DNA sa mga indibidwal na apoptotic na mga cell gamit ang comet assay at isang DNA crosslinking agent // Exp. Cell Res. - 1995. -221 (1). - P. 19-26.

18. Collins A.R., Duthie S.J. at Dobson V.L. Direktang enzymic detection ng endogenous oxidative base damage sa human lymphocyte DNA // Carcinogenesis. - 1993. -14. - P. 1733-1735.

19. Collins A.R., Dusinska M. at Horska A. Detection ng alkylation damage sa human lymphocyte DNA na may comet assay // Acta Biochim. Polon. - 2001. -48. - P. 611-614.

20. Smith C.C., O "Kinikilala ni Donovan M.R. at Martin E.A. HOGG1 ang oxidative damage gamit ang comet assay na may higit na specificity kaysa FPG o ENDOIII // Mutagenesis. - 2006. - 21. - P. 185-190.

21. Dusinska M. at Collins A. Detection ng lbumin purines at UV-induced photoproducts sa DNA ng mga solong cell, sa pamamagitan ng pagsasama ng lesion specific enzymes sa comet assay // Altern. Lab. Anim. - 1996. - 24. - P. 405-411.

22. Duthie S.J. at McMillan P. Uracil misincorporation sa DNA ng tao na nakita gamit ang single cell gel electrophoresis // Carcinogenesis. - 1997. - 18. - P. 1709-1714.

23. Merk O., Speit G. Detection ng mga crosslink na may comet assay na may kaugnayan sa genotoxicity at cytotoxicity // Environ. Mol. Mutagen. - 1999. - 33 (2). -P. 167-172.

24. Spanswick V.J., Hartley J.M., Hartley J.A. Pagsukat ng DNA interstrand crosslinking sa mga indibidwal na cell gamit ang single cell gel electrophoresis (comet) assay // Mga Paraan Mol. Biol. - 2010. - 613. - P. 267-282.

25. Hartley J.M., Spanswick V.J., Gander M. et al. Pagsukat ng DNA cross-linking sa mga pasyente sa ifosfa-mide therapy gamit ang solong cell gel electrophoresis (comet) assay // Clin. Cancer Res. - 1999. - 5. - P. 507512.

26. Wentzel J.F., Gouws C., Huysamen C. et al. Pagtatasa sa katayuan ng DNA methylation ng mga solong cell na may comet assay // Anal. Biochem. - 2010. - 400 (2). -P. 190-194.

27. Ang National Toxicology Program, Report on Carcinogens. - 2007; Ikalabing-isang edisyon.

28. Sasaki YF, Sekihashi K, Izumiyama F. et al. Ang comet assay na may maraming organ ng mouse: paghahambing ng mga resulta ng comet assay at carcinogenicity sa 208 na kemikal na pinili mula sa IARC monographs at US NTP Carcinogenicity Database // Crit Rev Toxicol. - 2000. -30 (6). - S. 629-799.

29. Toxicological at hygienic na pagtatasa ng kaligtasan ng mga nanomaterial: mga alituntunin. - M.: Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare, 2009.

Natanggap noong Pebrero 25, 2014

UDC 636.082.12

Pagkakaiba-iba ng polymorphism ng mga protina ng dugo sa mga kabayo ng mga lahi ng Yakutia

A.V. Chugunov, N.P. Filippova, M.N. Khaldeeva, N.P. Stepanov

Ang pag-aaral ng allele pool ng Yakut, Megezhek at Prilenskaya herd horse breed ay isinagawa ayon sa dalawang polymorphic blood system, ang antas ng genetic na pagkakaiba sa mga uri ng transferrin at albumin sa pagitan ng mga populasyon ng mga kabayo mula sa iba't ibang rehiyon ng Republic of Itinatag ang Sakha (Yakutia). Ang mga kabayo ng pinag-aralan na mga lahi ay nagpakita ng kakulangan ng heterozygous genotypes, tulad ng ipinahiwatig ng isang positibong halaga ng Fis. Ipinakita ng pag-aaral na ang populasyon ng herd horse ng tatlong lahi ay nasa stable genetic balance sa dalawang loci.

Mga pangunahing salita: allele pool, polymorphic blood system, locus, Yakut, Megezhek, Prilensky breed ng mga kabayo.

Pinag-aaralan ang allele pool ng mga herd horse ng Yakut, Megezheksky at Prilensky sa dalawang polymorphic blood system. Ang antas ng genetic na pagkakaiba sa mga uri ng transferrin at albumin sa pagitan ng mga populasyon ng

CHUGUNOV Afanasy Vasilyevich - Doctor of Agricultural Sciences, prof. YAGSKHA, pro [email protected]; FILIPPOVA Natalya Pavlovna - kandidato ng biological sciences, associate professor ng YAGSA, [email protected]; KHALDEEVA Matrena Nikolaevna - Kandidato ng Agricultural Sciences, Art. guro ng YAGSHA, [email protected]; STEPANOV Nikolai Prokopievich - Kandidato ng Agricultural Sciences, Associate Professor ng Departamento. YAGSKHA, [email protected]

Ang pamamaraan ay binubuo na ang isang imahe na may mga bagay na tulad ng kometa - "mga kometa", na isang set ng pinagsama at hiwalay na mga fluorescent na tuldok ng iba't ibang liwanag, ay ipinasok sa isang computer mula sa isang biological na paghahanda na naka-mount sa isang fluorescent microscope na may isang video camera. Pagkatapos, ang mga "comets" na ito ay hinahanap sa imahe, ang kanilang tabas ay nakikilala sa kahulugan ng mga hangganan ng "ulo" at "buntot", at ginaganap ang microscopic morphometry. Bago maghanap ng mga "comets" sa larawan, ino-optimize ang mga antas ng liwanag ng imahe at isinasagawa ang low-pass na pag-filter upang pagsamahin ang mga indibidwal na punto ng "comets" sa mga malabong lugar. Pagkatapos ay ang pagse-segment ng nagresultang imahe ay ginanap batay sa threshold ng liwanag, na tinukoy bilang isang offset mula sa background, paghahanap ng mga contour ng "comets" sa pamamagitan ng pagpuno sa isang limitadong lugar "na may isang buto", kung saan ang buto ay isang arbitrary na punto na kabilang sa "comet", paghahanap ng sentro ng ulo ng bawat "comet", sa pamamagitan ng pagtukoy sa sentro ng gravity ng mga puntos na may glow intensity malapit sa maximum. Ang kahulugan ng virtual na hangganan ng "ulo" at "buntot" ay isinasagawa sa pamamagitan ng pag-mirror sa pamamahagi ng mga intensity ng glow ng mga punto ng harap na bahagi ng ulo ng kometa, pagkatapos ay microscopic morphometry ng "comets" ay isinasagawa sa pamamagitan ng pagsukat: ang haba ng "kometa", "buntot", ang diameter ng "ulo". Pagkatapos ay kinakalkula ang porsyento ng DNA sa buong "comet", sa "buntot" at mga sukat ng pinsala sa DNA. Ang mga operasyong ito ay awtomatikong isinasagawa, nang sabay-sabay sa lahat ng "comets" sa isang serye ng mga imahe. Ang teknikal na resulta ay upang madagdagan ang katumpakan at bilis ng pagproseso at pagsusuri ng mga imahe ng "comets".

Ang isang paraan para sa pagproseso at pagsusuri ng mga larawan ng mga bagay na tulad ng kometa na nakuha ng pamamaraang "DNA-comets" (comet assay o single cell gel electrophoresis - SCGE), sa biological na paghahanda, ay tumutukoy sa larangan ng pagproseso at pagsusuri ng mga larawan ng mga bagay - "comets", at nilayon para sa computerization (automation ) na mga proseso ng morphometric studies sa larangan ng biomedicine, na isinasagawa upang matukoy ang antas ng pinsala sa mga molekula ng DNA na dulot ng iba't ibang mga ahente sa kapaligiran, upang pag-aralan ang pagkumpuni ng mga molekula ng DNA sa antas ng solong mga cell, upang masuri ang integral integridad ng genome, upang matukoy ang indibidwal na radiosensitivity ng mga pasyente ng kanser na sumasailalim sa radiation therapy, para sa bioindication ng coastal marine na tubig, sa madaling salita, para sa pagsubaybay sa isang malawak na hanay ng pinsala sa DNA na dulot ng mutagenic environmental factors.

Ang mga imahe ng "comets" ay isang hanay ng mga fused at hiwalay na fluorescent na tuldok ng iba't ibang ningning, na nakuha sa pamamagitan ng gel electrophoresis ng lysed solong mga cell ("DNA-comets" na paraan), samakatuwid, hindi posible na iproseso at pag-aralan ang mga ito gamit ang mga pamamaraan na inilaan para sa mga larawan ng mga ordinaryong (solid) na bagay.

Sa kasalukuyan, ang mga larawan ng "DNA comets" ay sinusuri sa pamamagitan ng visual observation sa ilalim ng fluorescent microscope at ang kanilang pagkakaiba ayon sa antas ng pagkasira ng DNA, o gamit ang computer image processing tools.

Sa visual analysis (Struwe M, Greulich K, Suter W, Plappert-Helbig U. Ang photo comet assay - Isang mabilis na screening assay para sa pagtukoy ng photogenotoxicity sa vitro. // Mutation Research / Genetic Toxicology at Environmental Mutagenesis. 2007, 632 ( 1-2), p.44-57) Ang "mga kometa ng DNA" ay niraranggo sa limang uri ng kondisyon na may katumbas na halagang numero mula 0 hanggang 4. Ang antas ng pinsala sa DNA ay ipinahayag bilang ang index na "mga kometa ng DNA" (I dna), tinutukoy ng formula

At dna =(0n 0 +1n 1 +2n 2 +3n 3 +4n 4)/ ,

kung saan ang n 0 -n 4 ay ang bilang ng "DNA comets" ng bawat uri, ay ang kabuuan ng mga binilang na "DNA comets".

Ang pamamaraang ito ng pagpoproseso at pagsusuri ay napakatagal, subjective, ay mayroon lamang limang antas ng pagkakaiba-iba ng gradasyon na "DNA-comets" at samakatuwid ay may mababang katumpakan, at samakatuwid ay mababa ang pagiging maaasahan ng mga resulta.

pinakamalapit sa iminungkahing teknikal na solusyon ay isang paraan ng computer analysis ng mga larawang "DNA-comets", na ipinatupad sa software SCGE-Pro (tingnan ang Chaubery R.C. Computerized Image analysis software para sa comet assay. Methods In Molecular Biology 2005; 291:97-106) na kinuha bilang prototype. Ang pamamaraang ito ng pagsusuri ng mga "comets" ay hindi gaanong matrabaho at lalo na kinakailangan para sa isang layunin na pagtatasa ng kanilang mga parameter (halimbawa, ang haba ng "comet", ang haba ng "buntot", ang diameter ng "ulo", ang porsyento ng DNA sa "ulo" o sa "buntot", atbp.), na ginagamit bilang mga tagapagpahiwatig na nagpapakilala sa antas ng pagkasira ng DNA sa mga pinag-aralan na selula. Ginagawang posible ng pamamaraan na makahanap ng "mga kometa" sa imahe at kalkulahin ang kanilang mga parameter nang manu-mano at awtomatiko.

Ang kawalan ng kilalang pamamaraan ay ang pamamaraan para sa pagtukoy ng mga hangganan ng "kometa" gamit ang isang hugis-parihaba na lugar, na binabawasan ang katumpakan ng pagkalkula ng mga parameter na kinakailangan para sa pagtatasa ng pinsala (lalo na kung ang pinsala ay banayad) ng DNA, dahil dito kaso, ang interference na nasa malapit ay maaari ding maiugnay sa kometa. . Bilang karagdagan, sa pamamaraang ito ng pagsusuri, ang hangganan ng "ulo" at "buntot" ay tinukoy bilang isang tuwid na linya, patayo sa axis ng "kometa" at hinahati ang kometa sa isang "ulo" at "buntot", na lubos na binabawasan ang katumpakan ng pagkalkula ng haba ng "buntot ng kometa" at ang porsyento ng DNA sa "ulo" at sa "buntot".

Ang teknikal na resulta ng pag-imbento ay upang madagdagan ang katumpakan at bilis ng pagproseso at pagsusuri ng mga imahe ng "comets" na nakuha ng "DNA-comets" na pamamaraan, kabilang ang pag-filter, pagse-segment ng "comets", na i-highlight ang kanilang contour sa kahulugan ng hangganan ng "ulo" at "buntot", na nagbibigay-daan upang madagdagan ang pagiging maaasahan ng mga resulta ng microscopic morphometry na kinakailangan para sa computerization ng biometric na mga proseso ng pananaliksik na isinasagawa habang sinusubaybayan ang isang malawak na hanay ng pinsala sa DNA na dulot ng iba't ibang mga mutagenic na kadahilanan sa kapaligiran.

Ang teknikal na resulta ay nakamit sa pamamagitan ng katotohanan na ang paraan ng pagproseso at pagsusuri ng mga imahe ng mga bagay na tulad ng kometa na nakuha ng pamamaraang "DNA-comets", na binubuo sa katotohanan na ang isang imahe na may mga bagay na tulad ng kometa - "comets" ay ipinasok. sa isang computer mula sa isang biological na paghahanda na naka-install sa isang fluorescent microscope na may isang video camera, na kumakatawan sa isang set ng pinagsama at hiwalay na mga fluorescent na tuldok ng iba't ibang liwanag, hinahanap nila ang mga "comets" na ito sa imahe, piliin ang kanilang contour na may kahulugan ng hangganan ng "ulo" at "buntot", nagsasagawa ng microscopic morphometry, habang bago maghanap ng mga "comets" sa imahe, ang pag-optimize ng mga antas ay isinasagawa ang liwanag ng imahe at low-pass na pag-filter upang pagsamahin ang mga indibidwal na punto ng "comets" sa malabo mga lugar, pagkatapos ay ang pagse-segment ng nagresultang imahe ay ginanap batay sa threshold ng liwanag, na tinukoy bilang isang offset mula sa background, paghahanap ng mga contour ng "comets" sa pamamagitan ng pagpuno ng isang limitadong lugar "na may isang buto", paghahanap ng gitnang "head" ng bawat isa. "kometa", sa pamamagitan ng pagtukoy dibisyon ng sentro ng grabidad ng mga puntos na may intensity ng glow na malapit sa maximum, ang kahulugan ng virtual na hangganan ng "ulo" at "buntot", sa pamamagitan ng pag-mirror ng pamamahagi ng mga intensity ng glow ng mga punto ng harap na bahagi ng "comet head", pagkatapos ay ang microscopic morphometry ng "comets" ay isinasagawa, sa pamamagitan ng pagsukat: comet", "tail", diameter ng "head" at pagkalkula ng porsyento ng DNA sa buong "comet", "sa buntot", mga sukat ng pinsala sa DNA at marami pang ibang mga parameter na nagpapakilala sa antas ng pagkasira ng DNA depende sa problemang niresolba, at ang mga nakalistang operasyon ay awtomatikong isinasagawa , sabay-sabay sa lahat ng "comets" sa imahe o serye ng mga imahe.

Ang pamamaraan ay isinasagawa sa pamamagitan ng pagsasagawa ng isang pagkakasunud-sunod ng mga sumusunod na pamamaraan:

1. Pagpasok sa isang computer mula sa isang biological specimen na naka-mount sa isang fluorescent microscope na may isang video camera, mga imahe na may mga bagay na tulad ng kometa - "comets", na isang set ng pinagsama at hiwalay na mga fluorescent na tuldok na may iba't ibang ningning.

2. Pag-optimize ng mga antas ng liwanag ng imahe. Zero brightness ang background, maximum brightness ang sentro ng ulo ng "comet".

3. Ang Gaussian low-pass na pag-filter (blurring) na may malaking radius na katumbas ng 1/10 ng average na "comet" radius ay ginagawa upang pagsamahin ang mga indibidwal na punto ng "comets" sa mga blur na lugar. Para maiwasan ang pagsasama-sama ng mga "comets" na malapit sa isa't isa, interactive na ginagamit ang blur radius adjustment.

4. Isinasagawa ang pagse-segment ng mga nagresultang blur na lugar batay sa threshold ng liwanag. Awtomatikong tinutukoy ang threshold bilang isang offset mula sa background (walang extraneous inclusions at iba pang mga bagay sa larawan maliban sa "comets"), ngunit ang threshold ay maaaring itama nang interactive.

5. Paghahanap ng mga contours ng "comets" sa pamamagitan ng pagpuno ng isang limitadong lugar "na may isang buto", kung saan ang buto ay isang arbitrary point na kabilang sa "comet".

Paghahanap sa gitna ng ulo ng kometa. Dalawang pamamaraan ang maaaring gamitin upang matukoy: sa pamamagitan ng pinakamataas na pamamahagi ng intensity ng glow ng "comet" na mga punto sa kahabaan ng pahalang na axis o sa pamamagitan ng sentro ng gravity ng mga punto na may glow intensity na higit sa 80% ng maximum.

Pagpapasiya ng virtual na hangganan ng "ulo" at "buntot", sa pamamagitan ng pag-mirror sa pamamahagi ng mga intensity ng glow ng mga punto ng harap na bahagi ng "comet head" (ang harap na bahagi ay ang bahagi hanggang sa harap na hangganan ng "ulo ng kometa").

Ang pagsasagawa ng microscopic morphometry ng "comets" sa pamamagitan ng pagsukat: ang haba ng "comet", ang haba ng "tail", ang diameter ng "head" at pagkalkula ng porsyento ng DNA sa buong "comet", "sa buntot ", mga sukat ng pinsala sa DNA at maraming iba pang mga parameter na nagpapakilala sa antas ng pinsala sa DNA, depende sa gawaing niresolba.

9. Ang output ng mga halaga ng nakuha na mga parameter ng bawat kometa ay isinasagawa sa talahanayan ng MS EXCEL upang ipatupad ang gawain ng gumagamit, halimbawa, para sa karagdagang istatistikal na pagsusuri o pag-uuri ng "mga kometa" ayon sa antas ng pinsala sa Istruktura ng DNA.

Kaya, sa iminungkahing pamamaraan, ang bawat lugar ng kometa ay tinutukoy ng kanilang kumplikadong tabas, na nagpapataas ng katumpakan ng pagkalkula ng mga parameter, sa kaibahan sa kilalang pamamaraan, kung saan ang mga hangganan ng "comets" ay tinutukoy gamit ang isang hugis-parihaba na lugar, na binabawasan ang katumpakan ng pagkalkula ng mga parameter na kinakailangan para sa pagtatasa ng pinsala (lalo na kung ang pinsala ay mahina na ipinahayag) "DNA-comets", dahil sa kasong ito, ang interference na malapit ay maaari ding maiugnay sa "comet". Bilang karagdagan, sa kilalang pamamaraan, ang hangganan ng "ulo" at "buntot" ay tinukoy bilang isang tuwid na linya, patayo sa axis ng kometa at naghihiwalay sa kometa sa isang "ulo" at isang "buntot". Ang iminungkahing paraan ay gumagamit ng isang virtual na hangganan, na tinutukoy sa pamamagitan ng pagkalkula sa gitna ng "comet head" at pag-mirror sa pamamahagi ng glow intensity ng mga punto ng harap na bahagi ng "comet head". Ito ay makabuluhang nagpapabuti sa katumpakan ng pagkalkula ng haba ng buntot ng kometa at ang porsyento ng DNA sa ulo at buntot.

Dapat tandaan na ang lahat ng mga nakalistang operasyon ay awtomatikong isinagawa nang sabay-sabay sa lahat ng "comets" sa isang imahe o isang serye ng mga imahe.

CLAIM

Isang pamamaraan para sa pagproseso at pagsusuri ng mga larawan ng mga bagay na tulad ng kometa na nakuha ng pamamaraang "DNA-comets", na binubuo sa pagpapakilala ng isang imahe na may mga bagay na tulad ng kometa - "mga kometa", na isang hanay ng mga pinagsama at hiwalay na mga fluorescent point ng iba't ibang liwanag, hanapin ang mga "comets" na ito sa imahe, i-highlight ang kanilang contour na may kahulugan ng hangganan ng "ulo" at "buntot", magsagawa ng microscopic morphometry, na nailalarawan sa na bago maghanap para sa "comets" sa imahe, liwanag ng imahe ang mga antas ay na-optimize at mababa ang dalas ng pag-filter upang pagsamahin ang mga indibidwal na punto ng "comets" sa mga blur na lugar, pagkatapos ay isasagawa ang pagse-segment ng nagreresultang imahe batay sa threshold ng liwanag, na tinukoy bilang isang offset mula sa background, paghahanap ng mga contour ng "comets" sa pamamagitan ng pinupunan ang isang limitadong lugar "na may isang buto", kung saan ang binhi ay isang di-makatwirang punto, na kabilang sa "kometa", paghahanap ang sentro ng ulo ng bawat "kometa" sa pamamagitan ng pagtukoy sa sentro ng gravity ng mga puntos na may glow intensity malapit sa maximum, pagtukoy ng virtual na hangganan ng "ulo" at "buntot" sa pamamagitan ng pag-mirror sa pamamahagi ng glow intensity ng mga punto ng harap na bahagi ng ulo ng kometa, pagkatapos ay ang microscopic morphometry ng "comets" ay isinasagawa sa pamamagitan ng pagsukat ng haba ng "comet", "buntot", ang diameter ng "ulo" at ang pagkalkula ng porsyento ng DNA sa buong "kometa", sa "buntot" at mga sukat ng pinsala sa DNA, at ang mga operasyon sa itaas ay awtomatikong ginagawa, nang sabay-sabay sa lahat ng "kometa" sa isang serye ng mga imahe.